IGF-1誘導神經干細胞向少突膠質細胞分化的機制

張殿君 譚 巖 付長峰 張利恒 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 3002)

少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，與多發性硬化、腦白質發育不良及腦脊髓損傷等中樞神經系統疾病關系密切。但體外誘導神經干細胞(NSCs)分化研究表明，NSCs雖然具有多分化潛能，但在自然分化狀態下分化為星形膠質細胞的潛能最大，少突膠質細胞所占比例最少〔1〕。因此，如能使用一定方法使NSCs定向分化為少突膠質細胞，可為中樞神經的損傷修復提供更多的種子細胞。研究發現胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對于神經細胞正常生長、發育的調節具有重要作用，可促進神經細胞的突觸形成、樹突快速生長及髓鞘生成;可以影響不同類型神經細胞及相關細胞的生存能力，提高神經細胞的分化和發育;可以促進少突膠質細胞以及髓鞘的生長，并能促進腫瘤壞死因子-α(TNF-α)脫髓鞘后的髓鞘再生〔2～5〕。因此，本研究擬探討IGF-1誘導脊髓源性NSCs向少突膠質細胞方向分化的機制，為探索治療脊髓損傷的新方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12(1∶1)培養基，B27添加劑，胎牛血清，購自Gibco公司;脂質體2000、抗磷酸化細胞外信號調節激酶(ERK)1/2抗體，購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒，購自TAKARA公司;ERK特異性抑制劑PD98059，購自Promega公司;新生24 h內的Wistar大鼠(SPF級)，由吉林大學動物室提供;重組載體pcDNA3.1-GFP-IGF由本實驗室自行構建并保存。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分離 新生Wistar大鼠斷頸處死后，無菌條件下取出脊柱，機械法分離細胞，用神經細胞培養液〔DMEM/F12為基礎培養基，B27添加劑終濃度為1%，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和重組人表皮生長因子(EGF)終濃度均為20 ng/ml〕調節細胞終濃度為2×105，接種到10 cm平皿，37℃、5%CO2培養箱中增殖培養。

1.2.2 轉染IGF-1基因脊髓源性NSCs的建立 傳代培養細胞接種于6孔培養板中，貼壁細胞達60% ～70%時，常規脂質體法轉染重組質粒pcDNA3.1-GFP-IGF-1。轉染后48 h，將細胞消化傳代至10 cm平皿中，用含G418(600 μg/ml)的DF完全培養基進行篩選，含300 μg/ml G418的完全培養基維持培養。

1.2.3 IGF-1對NSCs ERK1/2蛋白磷酸化的影響 在熒光顯微鏡下觀察轉染后細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達，以細胞開始表達時間點為0 h，按照0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h 時間點提取細胞蛋白質。Western印跡檢測磷酸化ERK1/2蛋白表達，具體步驟如下:各時間點提取蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，依次加入抗磷酸化ERK1/2抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，最后以二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.2.4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響 將終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L 的 ERK1/2 特異性抑制劑PD98059分別加入培養板中，與細胞共培養2 h，提取細胞蛋白質，利用Western印跡法檢測ERK磷酸化的改變。方法同1.2.3。

1.2.5 IGF-1對轉錄因子c-fos、c-jun和c-myc表達的影響 以細胞開始表達IGF-1 時間點為0 h，按照0 h、0.5 h、1 h、2 h 時間點提取細胞RNA，并利用RT-PCR檢測轉錄因子c-fos、c-jun和c-myc的表達。

1.2.6 ERK1/2特異性抑制劑 PD98059對轉錄因子c-fos、c-jun表達的影響 當細胞開始表達IGF-1時，向培養液中加入20 μmol/L 的 PD98059，共培養 1 h，提取細胞 RNA，利用 RTPCR檢測轉錄因子c-fos、c-jun的表達。

2 結果

2.1 IGF-1對處于分化狀態的NSCs ERK1/2磷酸化的影響 將IGF-1開始表達后的分化 NSCs，應用 Western印跡檢測ERK1/2蛋白的磷酸化情況。隨著時間的增加，NSCs中磷酸化的ERK1/2表達逐漸增高，2 h的時候增加最多，隨后表達下降。見圖1。

2.2 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響 將終濃度為 0、5、10、20、40 μmol/L 的 ERK1/2 特異性抑制劑PD98059分別加入培養板中和細胞共培養2 h，提取細胞蛋白質，利用Western印跡檢測ERK磷酸化的改變。PD98059抑制ERK磷酸化的程度隨著濃度的增加而增加，但濃度增加到20 μmol/L之后，再增加濃度抑制作用也不再增強。見圖2。

圖1 不同時間段IGF-1對ERK磷酸化的影響

圖2 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響

2.3 RT-PCR檢測轉錄因子c-fos、c-jun和c-myc的表達 應用RT-PCR檢測IGF-1開始表達后0 h、0.5 h、1 h和2 h時即早轉錄因子c-fos、c-jun和c-myc基因在NSCs中的表達，結果表明c-fos、c-jun mRNA表達水平在0.5 h和1 h時開始明顯增加，而c-myc mRNA水平在各時間點無明顯差別。見圖3。

圖3 IGF-1對NSCs的即早基因c-fos、c-jun、c-myc轉錄的影響

圖4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對IGF-1誘導即早基因c-fos、c-jun轉錄的影響

2.4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉錄因子c-fos、c-jun表達的影響 應用RT-PCR檢測IGF-1開始表達后，ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉錄因子c-fos、c-jun表達的影響。結果表明ERK1/2抑制劑PD98059可顯著抑制IGF-1誘導的c-fos和c-jun mRNA表達。見圖4。

3 討論

近年的研究表明，少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞。髓鞘使神經元的軸突產生電絕緣，有利于神經元之間電信號的傳導，少突膠質細胞和髓鞘的損傷必然導致中樞神經系統相應疾病，而少突膠質細胞移植到髓鞘缺陷或損傷的動物體內可形成新的髓鞘并促進軸突再生。因此，少突膠質細胞移植有望用來治療脊髓損傷導致的脫髓鞘等中樞神經系統疾病。在前期實驗研究中，已經證實了轉染了IGF-1的NSCs可以分化成少突膠質細胞。由于ERK在細胞增殖、分化和存活中起重要調節作用〔6，7〕，本研究在誘導NSCs向少突膠質細胞分化的基礎上，探討了MEK、ERK及下游轉錄因子c-fos和c-jun等在IGF-1誘導NSCs向少突膠質細胞分化中的作用。

本實驗應用Western印跡檢測了IGF-1開始表達后的分化NSCs中ERK1/2蛋白磷酸化情況。結果可見，隨著時間的增加，NSCs中磷酸化的ERK1/2表達逐漸增高;而ERK1/2特異性抑制劑PD98059可顯著抑制ERK的磷酸化程度，表明在IGF-1表達開始后，影響生長、分化、增殖的信號與ERK信號傳導通路有關聯，NSCs向少突膠質細胞分化的過程需要ERK1/2信號途徑的活化。

應用RT-PCR檢測IGF-1開始表達后，ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉錄因子 c-fos、c-jun表達的影響。結果表明ERK1/2抑制劑 PD98059可顯著抑制 IGF-1誘導的c-fos和c-jun mRNA表達。這些結果和前面ERK磷酸化的結果相結合，可以得出以下推論，NSCs轉染IGF-1并開始表達IGF-1之后，IGF-1啟動了ERK信號途徑，隨后將信號傳遞給即早基因c-fos、c-jun，然后 c-fos、c-jun 開始表達，最終導致了 NSCs分化為少突膠質細胞。

1 MacDonald SC，Simcoff R，Jordan LM，et al.A population of oligodendrocytes derived from multipotent neural precursor cells expresses a cholinergic phenotype in culture and responds to ciliary neurotrophic factor〔J〕.J Neurosci Res，2002;68(3):255-64.

2 Schechter R，Abboud M.Neuronal synthesized insulin roles on neural differentiation within fetal rat neuron cell cultures〔J〕.Brain Res Dev Brain Res，2001;127(1):41-9.

3 Arsenijevic Y，Weiss S.Insulin-like growth factor-1 is a differentiation factor for postmitotic CNS stem cell-derived neuronal precursors:distinct actions from those of brainderived neurotrophic factor〔J〕.J Neurosci，1998;18(6):2118-28.

4 Hsieh J，Aimone JB，Kaspar BK，et al.IGF-1 instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes〔J〕.J Cell Biol，2004;164:111-22.

5 Frederick TJ，Wood TL.IGF-1 and FGF-2 coordinately enhance cyclin D1 and cyclin E-cdk2 association and activity to promote G1 progression in oligodendrocyte progenitor cells〔J〕.Mol Cell Neurosci，2004;25(3):480-92.

6 Pan MR，Chang HC，Hung WC.Non-steriodal anti-inflammatory drugs suppress the ERK signaling pathway via block of Ras/c-Raf interaction and activation of MAP kinase phosphatases〔J〕.Cell Signal，2008;20(6):1134-41.

7 Korotayev K，Chausesepied M，Ginsber D.ERK activation is regulated by E2F1 and is essential for E2F1-induced S phase entry〔J〕.Cell Signal，2008;20(6):1221-6.