內皮抑制素對慢性阻塞性肺疾病肺血管重塑的影響

王昌明 蔣 明 呂 倩 梁榮感 李運千 (桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西 桂林 5400)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由氣道慢性炎癥引起的氣流受限性疾病，其發病率在全球呈明顯上升趨勢，尤其以中老年患者居多，對人類健康產生了嚴重的損害，已經受到各國的重視并制定了相應的診治指南。COPD氣流受限不完全可逆，隨著其病程的進展，外周氣道阻塞、肺實質破壞、肺血管的異常、長期慢性缺氧發生了缺氧性肺血管收縮，肺血管內皮功能失調和肺血管重塑等最終導致肺動脈高壓(PAH)的發生。其中，肺血管重塑在COPD的進展過程中起重要作用。血管內皮生長因子(VEGF)是近年來發現的一種具有高度特異性的細胞因子，具有促進血管內皮細胞分裂、誘發血管形成及增加血管通透性的功能〔1〕。VEGF貫穿于COPD發展的全過程中，與肺血管重塑密切相關，參與COPD并發肺動脈高壓的形成。內皮抑制素(Endostar)是一種特異性內源性血管生成抑制劑，能直接作用于血管，有效地抑制新生血管的生成〔2，3〕。有研究表明，Endostar能阻止血管內皮細胞進入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。本文通過觀察各階段COPD大鼠模型的VEGF的表達及其與肺血管重塑的關系，了解Endostar對其的干預效果，探討Endostar對COPD肺血管重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠64只，體重(180±20)g(購自桂林醫學院SPF級動物實驗中心)。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 脂多糖(美國Sigma公司)，香煙〔黃果樹(特醇)，貴州中煙工業公司出品，焦油含量:13 mg〕，重組人血管內皮抑制素Endostar，中國天津麥得津公司，批號:20080104，電腦小動物呼吸機TKR-400H(南昌新長征醫療科技發展有限公司)，BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，VEGF免疫組化抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化超敏S-P試劑盒KIT-9710(邁新生物技術開發公司)，RNA保存液(RNA LOCKER北京盛科博源生物科技有限公司)，VEGF及β-actin引物(上海生工生物工程有限公司合成)，RNAiso PLUS，、RT-PCR 試劑盒(TAKARA 大連寶生物生物工程有限公司)，大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒(美國ADL公司)，OLYMPUS熒光倒置顯微鏡(日本)，Image-pro-plus6.0圖像分析軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD模型的建立和動物分組 參照張建全等〔5〕方法建立動物模型。SPF級雄性SD大鼠64只，隨機分為8組，每組8只，分別納入實驗組及Endostar干預組。正常對照組(A):于第1，14天氣道內注入生理鹽水0.2 ml，4 w后檢測。慢支組(B):于第 1，14 天氣道內注入脂多糖(LPS，0.2 ml)200 μg/次，4 w后檢測。COPD組(C):第1，14天氣道內注入LPS 200 μg/次，大鼠放入自制有機玻璃箱內(0.22 m3)內予香煙煙霧暴露，1 h/d，共4 w。COPD并低氧組:第1，14天氣道內注入 LPS 200 μg/次，香煙煙霧暴露，1 h/d，共6 w。第5周起香煙煙霧暴露同時疊加18%低氧，每天8 h。Endostar干預組均自第3周起給予腹腔內注射 Endostar 7.5 mg·m－2·d－1(1.25 mg/kg)。空白對照組(A1)則從第3周起腹腔注射同Endostar劑量相同的生理鹽水。

1.2.2 氣道阻力及肺血流動力學測定及標本采集 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，接電腦小動物呼吸機TKR-400H，工作壓力統一調定為6 kPa，檢測氣道阻力。暴露胸腔，把連接有壓力換能器的導管插入肺動脈，通過壓力傳感器連接BL-420F生物機能實驗系統檢測平均肺動脈壓(mPAP)。采動脈血予1 500 r/min離心，取上清保存于－80℃冰箱待VEGF因子檢測。取右肺下葉組織浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行VG+維多利亞藍特殊染色觀察肺血管重塑情況，行免疫組化染色觀察VEGF表達情況。其余右肺組織放入RNA保存液(RNA LOCKER)中，于－80℃冰箱中備用，準備RNA提取。

1.2.3 HE染色及維多利亞藍+VG特殊染色觀察肺組織病理改變和肺血管重塑指標 大鼠右肺中葉組織HE染色觀測COPD大鼠模型各階段肺組織的病理改變、維多利亞藍+VG特殊染色觀察肺血管重塑指標。采用OLYMPUS熒光倒置顯微鏡及Image-pro-plus6.0圖像分析軟件進行數據分析。觀察肺血管重塑指標:400倍高倍鏡下對50 μm﹤直徑﹤100 μm的肌化性動脈進行圖像分析，計算血管壁厚度與血管外徑比(WT%)、血管壁面積與血管總面積比(WA%)。

1.2.4 RT-PCR檢測肺組織VEGF mRNA的表達 提取右肺組織總RNA，逆轉錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板行PCR。擴增引物:①VEGF的上游引物:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'，下游引物:5'-ATGCTGCAGGAAGCTCATCT-3'，擴增片段大小為385 bp。②β-actin的上游引物:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，擴增片段大小為220 bp。反應條件:95℃預變性 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，反應35個循環，72℃延伸7 min，產物在2.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠數字成像系統掃描分析擴增產物條帶，測定各擴增條帶吸光(A)值，以VEGF與β-actin的比值作為VEGF mRNA相對含量。

1.2.5 血清VEGF水平的測定 應用大鼠VEGF的ELISA檢測試劑盒檢測血清中的VEGF水平。操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 免疫組化S-P法檢測肺組織VEGF的表達水平 免疫組化步驟按S-P法試劑盒進行。VEGF一抗血清稀釋度為1∶100。用PBS替代相應一抗作陰性對照。VEGF陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位在胞漿。免疫組化切片放大400倍，以Image-pro-plus6.0軟件分析數據，選取直徑為50～100 μm肺動脈，分析各組肺血管免疫組化陽性細胞光密度值并進行比較。

1.3 統計學處理 實驗數據采用SPSS13.0軟件進行統計，計量資料數據用±s表示，對各組數據先進性正態檢驗和方差齊性分析，遵循正態分布、方差齊者組間兩兩比較采用S-N-K法分析，方差不齊者采用Games-Howell法。同一實驗組與藥物干預組間采用配對檢驗。將實驗大鼠血清VEGF濃度、肺組織VEGF mRNA表達及肺組織免疫組化的VEGF表達量分別與肺血管重塑指標WT%、WA%進行Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 氣道阻力變化 相同工作壓力下(6 Kpa)，大鼠氣道阻力指標A、B組無明顯變化(P＞0.05)，C、D組氣道阻力較A組增加，且B、C、D組氣道阻力依次遞增，差異有統計學意義(P＜0.05)。各藥物干預組與各自對應的試驗組比較C1組較C組、D1組較D組氣道阻力降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 肺血流動力學 平均肺動脈壓(mPAP)指標，與A組相比，B組與A組無明顯差異(P＞0.05)，而C、D組mPAP較A組明顯增高(P＜0.01)。各藥物干預組與各自對應的試驗組比較，可見C1組較C組，D1組較D組mPAP降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 肺組織病理改變及肺血管重塑指標 大鼠肺組織HE染色顯示，A組氣道結構正常，管壁完整，無炎癥細胞浸潤。B組氣道壁結構基本完整，有少量炎癥細胞浸潤。C組可見氣道上皮黏液杯狀細胞增生，部分肺大泡形成，氣道管壁可見炎癥細胞浸潤。D組氣道黏膜充血水腫，黏液杯狀細胞及氣道平滑肌增生明顯，小血管肌化明顯。氣道管壁炎癥細胞浸潤加重。說明B、C、D組病理表現符合慢支、COPD、COPD并低氧的病理改變。A1組、B1組與對應的A、B組相比，差異不明顯。C1組與C組相比炎癥細胞浸潤減少，肺大泡情況有改善。D1組比D組炎癥細胞浸潤減少，氣道平滑肌斷裂、小血管肌化等有所改善。

維多利亞藍+VG特殊染色分析血管重塑指標，與A組相比，B組肺血管重塑指標WT%、WA%無明顯變化(P＞0.05)，C、D組WT%、WA%比A組明顯增高(P＜0.05)。與D組相比，B、C兩組WT%比 D組降低，B組WA%比D組降低(P＜0.05)。C1組較C組，D1組較D組的WT%、WA%降低(P＜0.05)。而A1、B1組WT%、WA%與對應的試驗組A、B組比較無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

2.4 肺組織內VEGF mRNA的表達 與A組相比，B、C、D三組VEGF mRNA表達增強(P＜0.05)。D組VEGF mRNA表達強于B組(P＜0.05)。各藥物干預組與各自對應的試驗組比較，VEGF mRNA表達 A組與 A1組相比無明顯差異(P＞0.05)，B1組較B組，C1組較 C組，D1組較 D組肺組織內VEGF mRNA表達降低(P＜0.05)。說明 B、C、D組 VEGF mRNA表達逐漸增強，藥物抑制后，此三組的VEGF mRNA表達減弱。見表3，圖1。

表1 各組氣道阻力及平均肺動脈壓的比較 ± s，n=8)

表1 各組氣道阻力及平均肺動脈壓的比較 ± s，n=8)

與A組比較:1)P＜0.05;與D組比較:2)P＜0.05;與各自對應實驗組比較:3)P＜0.05，下表同

組別 氣道阻力(kPa)mPAP A組0.37±0.05 22.07±1.85 B組 0.39±0.042) 24.51±2.602)C組 0.51±0.041)2) 29.65±3.631)D組 0.61±0.071) 34.61±5.801)A1組 0.37±0.05 22.55±2.10 B1組 0.35±0.03 23.73±4.53 C1組 0.46±0.043) 23.99±3.823)D1組 0.51±0.083) 24.68±4.043)

表2 肺血管重塑指標分析(± s，n=8)

表2 肺血管重塑指標分析(± s，n=8)

組別WT% WA%A組13.36±1.33 44.90±4.21 B組 15.37±2.072) 49.70±5.101)C組 17.21±2.361)2) 56.92±6.631)D組 20.62±1.581) 61.57±5.891)A1組 12.66±1.80 44.25±3.75 B1組 13.13±1.43 47.84±2.12 C1組 14.06±2.283) 49.14±2.453)D1組 16.18±1.563) 52.76±4.463)

2.5 血清中VEGF的測定 分析不同組血清中VEGF濃度的變化，可見血清中血清中D組濃度明顯高于A組，差異有統計學意義(P＜0.05);各藥物干預組與各自對應的試驗組比較，可見B1組較B組，C1組較C組，D1組較D組血清中VEGF濃度降低(P＜0.05)。見表3。

2.6 肺血管VEGF免疫組化結果 免疫組化顯示VEGF陽性表達在氣道上皮及肺血管內皮細胞胞漿，呈棕黃色。與A組比較，C、D組 VEGF表達增高(P＜0.05)，而 A、B組間以及 C、D組之間表達無差異。各藥物干預組與各自對應的試驗組比較，肺血管免疫組化VEGF表達A組與A1，B組與B1組相比無明顯差異(P＞0.05)，C1組較C組，D1組較D組肺血管內皮的VEGF表達下降(P＜0.05)。提示COPD組及COPD并低氧組的VEGF表達顯著高于正常組，藥物干預后此兩組VEGF表達下調。見表3，圖2。

2.7 肺組織VEGF表達與肺血管重塑的相關性分析 將實驗大鼠血清VEGF濃度、肺組織VEGF mRNA表達及肺組織免疫組化的VEGF表達量分別與肺血管重塑指標WT%、WA%進行Pearson相關性分析，發現血清 VEGF濃度和肺小動脈的WT%、WA%呈正相關(血清VEGF濃度與WT%的相關系數r=0.780，血清 VEGF濃度與 WA%的相關系數 r=0.711，均P＜0.05);肺組織VEGF mRNA表達和肺小動脈的WT%、WA%呈正相關(VEGF mRNA表達與WT%的相關系數r=0.833，VEGF mRNA表達與WA%的相關系數r=0.729，均P＜0.05);VEGF表達量和肺小動脈的 WT%、WA%呈正相關(VEGF表達量與WT%的相關系數r=0.975，VEGF表達量與WA%的相關系數r=0.982，均P＜0.05)。

圖1 各組VEGF mRNA表達情況

表3 各組VEGF mRNA的表達情況、血清中VEGF濃度(ng/ml)及免疫組化VEGF在各組肺血管表達光密度值比較

圖2 肺組織VEGF表達情況(免疫組化染色，×400)

3 討論

多種因素如吸煙、低氧、炎性因子等均可刺激VEGF的分泌〔6〕。肺血管重塑在COPD并發的肺動脈高壓的形成、發展和維持中起重要作用。VEGF可通過激活血管平滑肌細胞內的活性氧(ROS)信號及 NF-κB轉錄致使血管平滑肌遷移，說明VEGF表達增加與肺動脈重塑有關〔7〕。Santos等〔8〕發現 COPD患者肺動VEGF的表達與疾病的嚴重程度相關，在無明顯缺氧的COPD早期VEGF表達增加，可能是內皮功能紊亂、血管重建中的一個重要的因子。Kranenburg等〔9〕發現COPD患者細支氣管、肺泡上皮細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及氣道平滑肌細胞VEGF及其受體表達明顯增加，同時說明VEGF及其受體不僅與COPD的血管重塑有關，也與COPD氣道重建、氣流受限的形成有關。Endostar能特異地作用于內皮細胞，尤其是微血管的內皮細胞，控制新生血管內皮細胞的增殖，誘導其凋亡，抑制其遷移，從而抑制血管生成和腫瘤生長〔10〕。目前在臨床已用于多種腫瘤的治療，具有較好的療效和安全性〔2，3〕。Kim〔11〕等報道內皮抑素通過結合 VEGF 受體KDR/Flk-1細胞膜外的結構域，阻斷VEGF誘導的KDR/Flt-1受體型酪氨酸激酶活化和下游事件，后者包括激活ERK、MAPK和FAK，從而抑制內皮細胞增殖和遷徙作用。伍尚敏〔4〕等研究發現，Endostar作用前血管內皮細胞VEGF cDNA表達量明顯高于Endostar作用后的表達量，Endostar能阻止血管內皮細胞進入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。

本結果COPD疾病過程中，隨著病程進展，VEGF表達逐漸上調，與疾病嚴重程度相關，給予Endostar干預后，疾病嚴重程度相關指標下降，提示Endostar可能通過拮抗內源性VEGF的產生來抑制微血管重塑，達到減緩COPD病程進展的目的。

1 Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors〔J〕.Nat Med，2003;9:669-76.

2 Mendoza L，Valcarcel M，Carrascal T，et al.Inhibition of cytokine-induced microvascular arrest of tumor cells by recombinant endostatin prevents experimental hepatic melanoma metastasis〔J〕.CancerRes，2004;64(1):304-10.

3 te Velde EA，Reijerkerk A，Brandsma D，et al.Early endostatin treatment inhibits metastatic seeding of murine colorectal cancer cells in the liver and their adhension to endostatin cells〔J〕.Br J Cancer，2005;92(4):729-35.

4 伍尚敏，趙亞南，楊 力，等.重組人血管內皮抑制素對血管內皮細胞的作用〔J〕.中國美容醫學，2008;17(5):685-8.

5 張建全，鐘小寧，蔣 明，等.慢性支氣管炎、肺氣腫時肺動脈高壓與肺血管壁改建與炎癥的關系〔J〕.中國病理生理雜志，2006;22(9):1811-5.

6 Voelkel NF，Cool C，Taraceviene-Stewart L，et al.Janus face of vascular endothelial growth factor:the obligatory survival factor for lung vascular endothelium controls precapillary artery remodeling in severe pulmonary hypertension〔J〕.Crit Care Med，2002;30:251-6.

7 Ma L，Tessier-Lavigne M.Dual branch-promoting and branch-repelling actions of Slit/Robo signaling on peripheral and central branches of developing sensory axons〔J〕.Neurosci，2007;27(25):6843-51.

8 Santos S，Victor I，Peinado VI，et al.Enhanced expression of vascular endothelial growth factor in pulmonary arteries of smokers and patients with moderate chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2003;167(9):1250-6.

9 Kranenburg AR，de Boer WI，Alagappan VKT，et al.Enhanced bronchial expression of vascular endothelial growth factor and receptors(Flk-1and Flt-1)in patients with chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Thorax，2005;59(2):106-13.

10 Jia YH，Dong XS，Wang XS.Effects of endostatin on expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and neovascularization in colonic carcinoma implanted in nude mice〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(22):3361-4.

11 Kim YM，Hwang S，Pym BJ，et al.Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-l〔J〕.J Biol Chem，2002;277(31):27872-9.