HPLC法測定雞嗉子葉中3種黃酮苷的含量

字 剛,丁中濤

(1.云南省藥物研究所制劑研究中心,云南 昆明 650111;2.云南大學化學科學與工程學院,云南 昆明 650091)

雞嗉子葉為山茱萸科植物頭狀四照花[Dendrobenthamia capitata(Wall.)Hutch.]的葉,功能消積殺蟲,消腫解毒,利水消腫。主治食積、小兒疳積、蟲積腹痛、肝炎、腹水、水火燙傷、外傷出血、瘡瘍。雞嗉子葉是彝族習用藥,臨床應用已有較長的歷史[1]。

該藥材收載于《云南省中藥材標準》(2005年版第4冊?彝族藥),無含量測定方法。筆者建立了金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷3種黃酮苷的含量測定方法,為控制雞嗉子葉藥材的質量提供科學的實驗依據。

1 實驗儀器和試藥

1.1 儀器 美國Agilent 1100高效液相色譜儀,Mettler AE163電子天平,HS6150D超聲清洗儀。

1.2 試劑和藥材 雞嗉子葉:分別來源于昆明西山090406,楚雄090510,大理090512(經云南省藥物研究所生藥室鑒定為山茱萸科植物雞嗉子);標準品:金絲桃苷和槲皮苷對照品為中國藥品生物制品檢定所提供,批號:金絲桃苷111521-200303(供含量測定);槲皮苷 111538-200403(供含量測定)。異槲皮苷為自制對照品,經HPLC檢測,純度大于98%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hanbon Lichrospher C18柱(4.6×150 mm,5 μ m),流動相 A:0.2%磷酸溶液B:甲醇,按表 1進行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,檢測波長為352 nm,在此條件下金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷對照品溶液及供試品溶液的色譜圖如圖1所示被測組分分離度均達到1.5以上,理論塔板數均不低于5000。

表1 流動相洗脫梯度

圖1 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取60℃減壓干燥2 h的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對照品適量,置容量瓶內,加甲醇適量,超聲處理使溶解,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,即得,每 1 mL 含金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷分別為 80μg、50μg、60μg 。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取雞嗉子葉藥材細粉1.0 g,精密加入甲醇50 mL,精密稱重,加熱回流提取 2 h,放冷,補足缺失重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4 線性關系 精密稱取在60℃減壓干燥2 h的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對照品 10.37 mg、8.51 mg、5.90 mg置 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得7#混合對照品溶液,精密吸取對照品溶液 2.5 mL、2.5 mL、1 mL分別置5 mL、10 mL、10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得 6#、5#、4#溶液,精密吸取 4#溶液 2.5 mL、1 mL、1 mL分別置5 mL、5 mL、10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得3#、2#、1#溶液。分別進樣10 μ L,測定,結果以濃度(mg/mL)為橫坐標(X),面積為縱坐標(Y),得回歸方程,見表2。

表2 線性關系測定結果

2.5 精密度試驗 取配制好的混合對照品溶液按照含量測定方法依法測定,連續進樣6針,以峰面積計算,結果3個組分的RSD均小于2%。

2.6 重復性試驗 稱取同一批供試品,按照制備方法同時制成6份供試液,進樣10μ L,測定。按2.4下所得回歸方程分別計算含量,結果3個組分的RSD均小于3%。

2.7 穩定性試驗 取已配制好的供試品溶液按照含量測定方法依法測定,分別于0,1,3,6,12,24 h進樣,進樣10 μ L,以峰面積計算,結果3個組分的RSD均小于3%。

2.8 加樣回收率試驗 分別取已知金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷含量的供試品6份,分別加入金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷的濃度為1.99 mg/mL,1.80 mg/mL,2.02 mg/mL的混合對照品溶液各1 mL,然后按確定好的樣品前處理方法同法制備,按供試品溶液的含量測定方法依法測定,計算回收率,結果見表3～表5。

表3 金絲桃苷加樣回收率試驗結果

表4 異槲皮苷加樣回收率試驗結果

表5 槲皮苷加樣回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定 樣品3批,分別依2.3項下方法制成供試品溶液,依法測定金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷含量,結果見表 6。

表6 樣品含量測定

3 小結

據現代文獻報道,雞嗉子葉和皮中含有黃酮類、三萜、環烯醚萜類、甾醇、多酚類和有機酸類化合物[2],筆者在對其化學成分研究過程中發現雞嗉子葉中含有多種黃酮類化合物,金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷的含量較其他黃酮類成分要高,選用以上3種組分作為指標物,采用高效液相色譜法對雞嗉子葉中黃酮類成分進行含量測定研究。

以甲醇、乙醇、50%甲醇為溶劑考察黃酮苷的提取方法,結果發現以甲醇為溶劑,加熱回流2 h雞嗉子葉中金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷3種組分提取率最高,提取較完全。

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上海科學技術出版社,1999:743～744.

[2]田雅娟,羅應剛,李伯剛,等.山荔枝化學成分的研究[J].天然產物研究與開發,2002,14(3):18～20.