腦膠質(zhì)瘤細胞SHG44與U87-MG輻射敏感性差異及其機制初步研究

孫志強

（常州市第二人民醫(yī)院放療科，江蘇 常州 213000）

腦膠質(zhì)瘤屬膠質(zhì)細胞源性的良、惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中惡性膠質(zhì)母細胞瘤是成人原發(fā)性腦腫瘤中最普遍的亞型[1]，因為大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長且與周圍腦組織邊界不清，所以治療十分困難。放射治療是最有效的輔助治療，但膠質(zhì)瘤為中等放射敏感度，如何增加腫瘤組織的輻射敏感性，減輕正常組織損傷，以提高治療效果，是我們的目的所在。環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase，COX-2）在許多惡性腫瘤中呈高表達，與局部浸潤、遠處轉移及預后等關系密切[2]。許多研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑在體外和動物實驗中均有抗腫瘤與放射增敏作用，但其具體作用機制目前尚不清楚[3-5]。本實驗通過克隆法、反轉錄聚合酶鏈反應（Reverse transcriptase PCR，RT-PCR）法檢測60Co-γ射線照射兩種膠質(zhì)瘤細胞SHG44與U87-MG克隆存活率及COX-2 mRNA表達水平的關系，探討膠質(zhì)瘤細胞輻射敏感性差異的可能機制，為尋求增強放射敏感性藥物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

腦膠質(zhì)瘤細胞SHG44及細胞U87-MG，由蘇州大學腫瘤放射生物研究室提供；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清購（四季青）；RNeasy Mini Kit，QIAshredder Homogenizers（QIAGEN）；Rtase M-MLV/RTase Hˉ，Random primers（Takara）；COX-2引物、18S rRNA引物（生工）。

1.2 方法

1.2.1 輻照條件

60Co-γ射線（劑量率1Gy/min，源距2.8m）輻照。

1.2.2 克隆法檢測細胞存活率

以對數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液，接種24h后細胞貼壁，給予不同劑量60Co-γ射線照射，照射后胰酶消化制備單細胞懸液，以500個細胞/皿接種至60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)11～12d后甲醇固定、Gimsa染色后，顯微鏡下計數(shù)50個細胞以上的細胞集落。每組每個劑量點設三個平行樣。計算各種實驗條件下的克隆形成率。應用Graphpad prism 5 Demo 軟件，以單擊多靶模型S= 1 - （1 - e - D/ Do） N，擬合細胞存活曲線，測定、計算Do、Dq和SF2等多個放射生物學參數(shù)。獨立性實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR法測定COX-2 mRNA的表達水平

對數(shù)生長期的SHG44細胞和U87-MG接種24h后，胰蛋白酶消化，收集細胞。RNeasy Mini Kit提取細胞總mRNA。總RNA先逆轉錄反應合成第一鏈。取1μL逆轉錄反應產(chǎn)物進行PCR擴增，COX-2上游引物為5’-TGAAACCCACTCCAAACACA-3’，下游引物 3’-AACTGATGC GTGAAGTGCTG-5’，18S rRN下游引物5’-GTAACCCGTTGAACCC CATT-3’，下游引物3’-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-5’。反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，擴增25個循環(huán)PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠水平電泳分離，并與DNA分子量Marker進行比較，Bandscan5.0圖像分析軟件行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 克隆法測定60Co-γ線照射對SHG44和U87-MG細胞存活率的影響

隨著照射劑量的增加，細胞漸失去分裂增生的能力，在10 Gy組僅有極少數(shù)細胞能形成克隆。圖1不同照射劑量下SHG44和U87-MG細胞的存活曲線；兩種細胞的存活分數(shù)隨著照射劑量的增高而下降，屬于單擊多靶模型。

表1為采用單擊多靶模型擬合后獲得的多個放射生物學參數(shù)：平均致死劑量D0，細胞受損所需準閾劑量Dq，2Gy時細胞存活分數(shù)SF2。

由表1可見，U87-MG細胞的D0、Dq、SF2值均較SHG44細胞的值小，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR測定SHG44、U87-MG細胞COX-2 mRNA表達水平，見圖2和表2。

圖1 60Co-γ線照射后SHG44和U87-MG細胞克隆形成率

表1 SHG44和U87-MG細胞放射增敏參數(shù)（±s，n＝3）

與SHG44細胞相比，*P＜0.05

細胞組別 D0 Dq SF2 SHG44 3.18±0.21 2.63±0.11 0.83±0.03 U87-MG 3.07±0.17* 1.86±0.09* 0.74±0.02*

圖2 SHG44和U87-MG細胞COX-2 mRNA與18S rRNA表達

圖2示，SHG44和U87-MG細胞組COX-2 mRNA與18S rRNA泳道上可見一大小與引物設計理論值相符的特異性擴增條帶。以18S rRNA灰度定為1，COX-2 mRNA 相對表達量=COX-2 cDNA/18S rRNA cDNA。

表2 SHG44細胞COX-2 mRNA相對表達水平

表2中，U87-MG細胞COX-2 mRNA相對表達水平較SHG44細胞高，其差異具有顯著性 （P＜0.01）。

3 討 論

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是參與花生四烯酸轉化為各種內(nèi)源性前列腺素（PGs）過程中重要的限速酶，參與機體的多種病理生理過程。其中COX-2是一種誘導型酶。近年來研究顯示，COX-2在一些腫瘤中存在過度表達現(xiàn)象，提示COX-2可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6]。國外相關研究表明放療中射線是刺激COX-2表達的一種因素，能增強細胞內(nèi)COX-2的表達水平，并隨具有劑量效應[7]。

從細胞存活曲線圖發(fā)現(xiàn)，兩種膠質(zhì)瘤細胞的存活分數(shù)隨輻射劑量的增高呈指數(shù)性降低，細胞的劑量-存活曲線符合單擊多靶模型。放射生物學參數(shù)中，D0是存活率下降63%所需劑量，D0越小，放射敏感性越強；Dq代表細胞累積亞致死性損傷的能力，Dq減小，放射敏感性增強；SF2是代表細胞放射敏感性的重要指標，SF2越大，放射抗拒性越強。U87-MG細胞的D0、Dq、SF2值均小于SHG44細胞，其差異具有顯著性（P＜0.05），表明U87-MG細胞的輻射敏感性大于SHG44細胞。本實驗中，檢測了兩種膠質(zhì)瘤細胞SHG44與U87-MG 的COX-2 mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)U87-MG細胞的COX-2 mRNA相對表達水平高于SHG44細胞，其差異具有顯著性（P＜0.01）。Pyo H等[8]用COX-2選擇性抑制劑NS-398處理人NCI-H460肺癌移植瘤裸鼠時發(fā)現(xiàn)，NS-398的輻射增敏作用與細胞表達COX-2的能力相關。NS-398聯(lián)合輻射可顯著抑制高表達COX-2的NCI-H460肺癌移植瘤的生長。Amirghahari[9]等認為COX-2選擇性抑制劑通過COX-2蛋白依賴機制增強細胞的輻射敏感性。由此我們推測膠質(zhì)瘤細胞的輻射敏感性與其COX-2 mRNA表達水平密切相關，這些實驗結果為放療過程中應用靶向調(diào)節(jié)COX-2 水平的藥物提供重要的參考。

[1]Legler JM,Gloeckler Ries LA,Smith MA,et al.Brain and other central nervous system cancers:recent trends in incidence and mortality[J].Natl Cancer Inst,1999,91(16):1382-1390.

[2]Patrignani P,Tacconelli S,Sciulli M G,et al.New insights into COX-2 biology and inhibition[J].Brain Res Brain Res Rev,2005,48(2): 352-359.

[3]Thomas W,Janet M,Mark D,et al.Synergy between Celecoxib and Radiotherapy Results from Inhibition of Cyclooxygenase-2-Derived Prostaglandin E2, a Survival Factor for Tumor and Associated Vasculature[J].Cancer Res,2004,64(1): 279-285.

[4]Nakata E,Mason K A,Hunter N,et al.Potentiation of tumor response to radiation or chemoradiation by selective cyclooxygenase-2 enzyme inhibitors[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2004,58(2): 369-375.

[5]Uma Raju,Hisanori Ariga,Klaus Dittmann,et al.Inhibition of DNA repair as a mechaniem of enhanced radioresponse of head and neck carcinoma cells by a selective cyclooxygenase-2 inhibitor,celecoxib[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,63(2): 520-528.

[6]Williams CS,MannM,DuBois RN.The role of cyclooxygenases in inf l ammation,cancer,and development[J].Oncogene,1999,18(55):7908-7916.

[7]Tang C,Liu C,Zhou X,et al.Enhanced inhibitive effects of combination of rofecoxib and octreotide on the growth of human gastric cancer[J].Int J Cancer,2004,112(3):470-474.

[8]Pyo H,Choy H,Amorino GP,et al.A Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitor,NS-398,Enhances the Effect of Radiation in Vitro and in Vivo Preferentially on the Cells That Express Cyclooxygenase-2[J].Clin Cancer Res,2001,7(10):2998-3005.

[9]Amirghahari N,Harrison L,Smith M,et al.NS398 radiosensitizes an HNSCC cell line by possibly inhibiting radiation-induced expression of COX-2[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2003,57(5):1405–1412.