兔抗人TGF-β1多克隆抗體的制備

郭 冉，劉潔婷，吳 丹，徐秋玲，初彥輝※

(1.牡丹江醫學院生理教研室，黑龍江牡丹江157011;2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點實驗室，黑龍江牡丹江157011)

轉化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是目前已知的與瘢痕形成關系最為密切的細胞因子，研究最為廣泛［1，2］。它既可以促進細胞外基質的合成又可以抑制其降解。在創傷中TGF-β1的表達增加，同時還能刺激成纖維細胞產生內源性TGF-β1，甚至加入外源性的TGF-β1可以增加創傷中膠原纖維蛋白和炎性細胞的數量［3］。陳永平等［4］曾提出將TGF-β1構建為疫苗，刺激機體產生抗體，中和體內產生的過量的 TGF-β1。相關文獻報道，抗TGF-β1抗體具有中和 TGF-β1活性的作用［5］，抗TGF-β1抗體能明顯抑制成纖維細胞的超微結構，能抑制成纖維細胞的增殖和膠原合成［6］。

1 材料與方法

1.1 材料 人重組TGF-β1蛋白由黑龍江省抗纖維化生物治療重點實驗室提供;雄性新西蘭白兔2只，4.5～5 個月齡，體質量(2.2 ±0.2)kg。購自黑龍江省中醫藥大學動物中心。可拆卸酶標板為Corning公司生產。弗氏不完全佐劑(Freunds adjuvant，incomplete)、弗氏完全佐劑 (Freunds adjuvant，complete)購自 Sigma公司。3，3，5，5-四甲基聯苯胺鹽酸鹽購自AMRESCO公司。UPS-蛋白質銀染試劑盒由溫州安得森生物科技有限公司惠贈;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原乳化 用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH=7.4)將 TGF-β1蛋白稀釋至1 μg/L，按體積比1∶11加入弗氏佐劑，混合至乳狀，待成為乳白色黏稠的油包水乳劑時，將佐劑抗原滴入冰水表面，滴入后10 min應保持完整而不分散時，即為合格［7］。

1.2.2 免疫動物 動物免疫前，由耳緣靜脈取血5 mL，分離血清，置－20℃保存，作為陰性對照。取充分乳化后蛋白，皮下多點注射新西蘭白兔，每只用量為0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐劑加強免疫1次。共加強免疫3次，后兩次加強免疫直接靜脈注射不含佐劑的抗原0.5 mg。第21天開始耳緣靜脈取血檢測效價，末次免疫7 d后頸總動脈采血收集抗血清，分裝后－80℃保存。

1.2.3 純化多克隆抗體 采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體［8］。①取兔血清10 mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加飽和硫酸銨20 mL，于4℃緩慢攪拌3～4 h，使蛋白充分沉淀。②4℃離心，3000 r/min，30 min，棄上清，用 6 mL 生理鹽水溶解沉淀，緩慢滴加4 mL飽和硫酸銨，4℃緩慢攪拌1 h。重復②步。③4℃離心，用6.7 mL生理鹽水溶解沉淀，滴加3.3 mL飽和硫酸銨，4℃緩慢攪拌1 h。重復③步。④4℃離心，用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH=7.4)2 mL溶解沉淀，磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)透析，更換3次磷酸鹽緩沖液，4℃緩慢搖動過夜，得到抗血清，分裝后置－20℃保存備用。

1.2.4 檢測多克隆抗體的效價 將TGF-β1重組蛋白用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)稀釋成0.025 μg/L，每孔100 μL 體積包被反應板，4℃過夜;37℃封閉2 h，再4℃過夜;將純化后多抗兔血清用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)倍比稀釋(1∶1200～1∶125 600)，同時取免疫前血清1∶1500稀釋，作為陰性對照。每組3個復孔。每孔100 μL體積加入反應孔中，37℃，1 h;加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔酶標抗體稀釋液 100 μL(1∶14 000)，37℃，1 h;加入3，3，5，5-四甲基聯苯胺鹽酸鹽工作液 100 μL，于37℃避光顯色15～30 min;加入2 mol/L H2SO4終止反應;酶標儀450 nm波長檢測各孔OD值。P/N值=(A樣品-A空白對照)/(A陰性樣品-A空白對照)，P/N值≥2.1判為陽性，反之則為陰性。陽性反應的最大稀釋度即為待測樣品的效價［9］。

1.2.5 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測抗體 取純化后的抗血清，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測，確定純化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及純化的效果。

1.2.6 Western blot檢測抗體 取人重組TGF-β1蛋白10 μL，以純化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗體作為一抗(1∶110 000)，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔酶標抗體作為二抗，進行Western blot檢測抗體的特異性。

2 結果

2.1 多克隆抗體效價測定 間接酶聯免疫吸附試驗測得純化后抗體效價為1∶112 800。

2.2 SDS-PAGE檢測抗體 純化后的抗血清經還原型SDS-PAGE檢測，結果如圖1，主要蛋白條帶在約50×103位置，符合兔免疫球蛋白基本特征，另外，在20×103左右出現較彌散的條帶，為免疫球蛋白輕鏈分子。

圖1 SDS-PAGE分析多克隆抗體

圖2 免疫印跡分析多克隆抗體

2.3 Western blot檢測抗體 以純化后的多克隆抗體作為一抗，與人重組TGF-β1蛋白進行Western blot免疫印跡分析，結果如圖2所示。結果表明，多克隆抗血清與TGF-β1蛋白分子量位置發生反應，說明制備的多克隆抗體能與目的蛋白特異性結合。

3 討論

抗 TGF-β1抗體，作為 TGF-β1有效的拮抗劑，能競爭性抑制TGF-β1與其受體結合，阻斷其生物活性，從而避免或者減輕TGF-β1對機體產生的不利影響，并對各種器官的纖維化治療起到一定的作用。一些研究TGF-β與瘢痕形成的關系發現，應用抗TGF-β抗體可能會減輕瘢痕。Shah等［10］的研究顯示，在成年大鼠皮下局部注射TGF-β1和TGF-β2抗體可降低TGF-β的水平，減少單核細胞、巨噬細胞的數量，減少Ⅰ型和Ⅱ型膠原的沉積，結果瘢痕顯著減少。經抗體處理后的動物模型傷口，其膠原的沉積、巨噬細胞和血管的增生等均比對照組減少，其張力和皮膚結構則與對照組一致。在創傷早期應用抗TGF-β 抗體對降低 TGF-β 水平，避免 TGF-βmRNA自我誘導，限制巨噬細胞增生和TGF-β的釋放具有重要作用。

目前，對 TGF-β抗體的研究多為體外實驗，且TGF-β抗體成品比較昂貴，使其應用受到限制。本實驗以TGF-β1蛋白作為抗原，在動物體內制備多克隆抗血清。經飽和硫酸銨鹽析法純化后，間接酶聯免疫吸附試驗檢測多克隆抗體效價達1∶110 000以上。SDS-PAGE分析及Western blot檢測，本研究所獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體純度較高，能與TGF-β1目的蛋白特異性結合。為進一步研究與TGF-β1密切相關的疾病，特別是抗纖維化的研究提供了有利條件，奠定了物質基礎。

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