p16INK4A在宮頸非典型鱗狀細胞中的診斷作用

武 玲，宋靜慧

(1.內蒙古婦幼保健院婦產科，呼和浩特010020;2.內蒙古醫學院第一附屬醫院婦產科，呼和浩特010050)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，國內外最新研究表明，宮頸癌是一種感染性疾病，是可以預防、可以治愈的疾病［1，2］。液基薄層細胞學(thinprep cytologic test，TCT)明顯提高了對各種宮頸癌前病變的檢出率，但非典型鱗狀細胞(atypical squamous of undermined significance，ASCUS)由于相當大的重疊對不同的標準會有不一致的判斷。因此，臨床上迫切需要一種生物標志物作為TCT的輔助手段對ASCUS進行合理檢測和隨訪分流。2003年，Nieh等［3］首次報道了p16INK4A免疫組化染色可成功地應用于宮頸細胞涂片，作為ASCUS涂片輔助診斷的指標有助于澄清這一較模糊的婦科細胞病理學概念。近年來研究顯示，抑癌基因p16INK4A幾乎在100%的宮頸癌和宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ中過表達，認為p16INK4A蛋白有望作為宮頸核異質細胞的標志物并可評估宮頸病變嚴重程度［4］，提示其可能對ASCUS的再分類起一定的作用。本研究采用TCT診斷為ASCUS的剩余標本進行p16INK4A免疫細胞化學檢測，將ASCUS再分類，探討p16INK4A在宮頸ASCUS中的表達及其診斷價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2006年8月至2007年10月在內蒙古醫學院第一附屬醫院婦產科門診進行TCT宮頸細胞學檢查的患者5321例。選擇細胞學檢查結果為ASCUS的患者為實驗組(148例)，占同期門診宮頸細胞學檢查總數的 2.9%(148/5321)，患者平均年齡為(35.8 ±10.1)歲。ASCUS患者中有白帶增多、接觸性出血或異常陰道流血等臨床癥狀的病例為 53例，占35.8%(53/148);婦科檢查發現宮頸糜爛病例為115例，占 77.7%(115/148)。再根據異常程度和本人意愿進行陰道鏡或宮頸病變處的活檢。對照組:選擇細胞學檢查結果為正常宮頸細胞的患者10例;炎性反應性改變20例;低級別鱗狀上皮內病變(low squamous epithelium lesions，LSIL)10 例;高級別鱗狀上皮內病變(high squamous epithelium lesions，HSIL)10例;鱗癌4例。以上所有病例均為無子宮切除史、宮頸手術史、骨盆放射治療史，目前無妊娠的婦女。

1.2 標本處理 將TCT的剩余細胞標本放入無菌試管內振蕩洗滌，離心沉淀后用稀釋后取80 μL用電動離心涂片機甩片，自然干燥后用磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3次。

1.3 試驗方法 免疫組化染色采用S-P法:①涂片滴加0.3%過氧化氫甲醇溶液，室溫下孵育10 min。②加正常小牛血清，室溫下孵育10 min。③傾去血清，加 p16INK4A(2 mg/mL)單克隆抗體，4℃過夜。④加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10 min，加入鏈霉菌抗生物-過氧化物酶活物，室溫下孵育10 min。⑤磷酸鹽緩沖液沖洗涂片后DAB顯色，蘇木精復染。

1.4 染色觀察標準 細胞核或細胞質內出現有棕黃色顆粒為陽性，按其著色有無及強弱程度劃分為:癌陽性細胞數＜5%或無陽性著色為陰性(－)，陽性細胞數在6%～25%間為弱陽性(+)，陽性細胞數在26%～50%間為陽性(++)，陽性細胞數＞50%為強陽性(+++)。

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組p16INK4A在不同宮頸細胞學中的免疫組化染色結果 在宮頸脫落細胞中，p16INK4A在正常、炎癥、ASCUS、LSIL、HSIL、鱗癌中表達的陽性率分別為0% 、5% 、24.3% 、90% 、100% 、100% 。不同程度的宮頸疾病的細胞免疫化學，其p16INK4A表達差異有統計學意義(χ2=62.67，P ＜0.05)(表 1)。

表1 p16INK4A在不同宮頸細胞學病變中的表達情況

2.2 實驗組148例ASCUS宮頸活檢組織病理結果經宮頸活檢確診，148例宮頸細胞學檢查為ASCUS的患者中，宮頸 CIN為 39例，占總數的 26.4%(39/148)。其中 CINⅡ級和 CINⅢ級為17例，占CIN的43.6%(17/39)。另外，148例 ASCUS中，宮頸浸潤癌為2例，占總數的1.4%(2/148)。

2.3 實驗組p16INK4A在ASCUS中免疫組化染色結果148例ASCUS中有36例陽性表達，在經病理證實為2例鱗狀細胞癌p16INK4A表達均為強陽性，陽性率為100%。5例宮頸CINⅢ級p16INK4A表達均為強陽性，陽性率為100%。12例宮頸 CINⅡ級陽性率為91.7%。22例CINⅠ級陽性率為77.3%。107例慢性宮頸炎陽性率為0.9%。不同程度的宮頸病變的細胞免疫化學，其p16INK4A表達的差別有統計學意義(χ2=116.65，P ＜0.05)(表2)。

表2 p16INK4A在不同宮頸組織病變中的表達情況［例(%)］

比較p16INK4A的表達在宮頸炎與CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級之間，宮頸炎與宮頸鱗癌之間，陽性率差異均有顯著性(P＜0.05)。比較 p16INK4A的表達在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗癌之間，陽性率均無顯著性差異(P＞0.05)，而染色強度均有顯著性差異(P ＜0.05)。

3 討論

子宮頸癌是常見的女性生殖器官惡性腫瘤，但是可以預防，可以治愈的，其關鍵在于認真篩查宮頸CIN，早期診斷、早期治療，預防宮頸癌的發生。TCT的出現明顯提高了細胞學診斷的準確率、陽性率。在此之前的研究發現，經過長期隨訪原細胞學診斷為ASCUS的婦女有20%發展為LSIL，10%發展為HSIL［5］。因此，進一步完善和改進宮頸癌前病變篩查和診斷方法，尋找對ASCUS有診斷價值的生物標志物有重要的意義。

p16INK4A基因是1994年6月由美國鹽湖城Kamb等［6］報道的一種新型抑癌基因，定位于人染色體9p21，編碼含148個氨基酸的核結合蛋白，其產物p16INK4A蛋白參與細胞周期的調節，可與細胞周期素cyclinD1競爭性結合CDK4和CDK6，通過抑制CDK4和CDK6激酶的活性，而使pRb不能磷酸化，從而抑制細胞增殖，同時高磷酸化的pRb可誘導p16INK4A基因的表達。p16INK4A在 CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F細胞周期調節途徑中起著負反饋的作用，一旦p16INK4A基因發生變異，上述環路就會無限制地進行下去，最終導致腫瘤的發生。

將p16INK4A免疫組織化學染色檢查方法和宮頸細胞學方法結合，尤其對于細胞學診斷為ASCUS的患者，有重要的臨床應用價值。Guo等［7］研究進一步證實p16INK4A作為宮頸病變的分子標志物，不僅運用于宮頸組織標本的檢測，還運用于對ASCUS的細胞學涂片進行分層處理。本研究中，p16INK4A在宮頸脫落細胞中診斷為正常、炎癥、ASCUS、LSIL、HSIL、鱗癌中表達的陽性率分別為0%、5%、90%、100%、100%。在正常宮頸與細胞學診斷的宮頸癌前病變之間均有顯著性差異，在慢性宮頸炎與細胞學診斷的宮頸癌前病變之間均有顯著性差異，在 LSIL、HSIL、鱗癌之間陽性率均無顯著性差異。

2006年，吳韓梅等［8］報道，采用免疫組化法檢測p16INK4A發現隨著宮頸病變的進展其陽性表達率逐漸升高。Murphy等［9］研究認為p16INK4A免疫反應性在慢性宮頸炎組基本不表達，CINⅠ級為較低強度表達和零星表達，CINⅢ級以上的表達為彌漫表達。這和本研究結果相似，在后來臨床隨訪組織學結果中隨宮頸病變的進展p16INK4A染色強度顯著增加。試驗中可以看出:p16INK4A同樣可以應用于TCT細胞學涂片，具有和組織化學同樣的陽性預測，背景更加清晰直觀，較Bibbo等［10］用TCT標本離心后的細胞沉渣石蠟切片方法簡單易行。

總之，p16INK4A輔助應用于宮頸ASCUS的篩查和診斷，其檢測方法簡單、易于操作，對ASCUS的隨訪、治療、預后具有重要價值，有望作為ASCUS再分類的生物學指標。

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［10］Bibbo M，Klump WJ，DeCecco J，et al.Procedure for immunocytochemical dstection of p16INK4Aantigen in thin-layer，liquid-based specimens［J］.Acta Cytol，2002，46(1):25-29.