國產克霉唑乳膏微生物限度檢查方法研究及衛生狀況評價

蔣受軍，劉濤，朱斌#，韋濤，黃橘，劉常凱（.廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，南寧市5300；.桂林醫學院，桂林市 54004）

克霉唑具廣譜抗真菌活性，對表皮癬菌、毛發癬菌、曲菌、著色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有顯著抑制作用。克霉唑乳膏為皮膚科及婦科用藥類非處方藥，用于體癬、股癬、手癬、足癬、花斑癬、頭癬以及念珠菌性甲溝炎和念珠菌性外陰陰道炎，為外用制劑，是2005年版《中國藥典》二部收載品種[1]。克霉唑對真菌有抑制作用，對這類具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查時，應首先消除其抗菌活性，并通過試驗驗證抗菌活性的去除是否徹底，以保證檢驗結果的有效性。《中國藥典》克霉唑乳膏標準正文中未收載微生物限度檢查方法，現按照2005年版《中國藥典》二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法有關規定[1]，對克霉唑乳膏的微生物限度檢查方法進行研究驗證，并用建立的方法對全國各企業生產的克霉唑乳膏進行微生物限度考察，以對國內克霉唑乳膏產品的微生物污染狀況進行分析評價。結果，所建立方法適用性好；國產克霉唑乳膏衛生狀況良好。

1 儀器與材料

1.1 儀器

D-53電熱恒溫培養箱（德國Binder公司）；HHB11.600電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；HR1自動菌落計數儀（杭州訊數科技有限公司）；OLY生物顯微鏡（日本Olympus公司）；SG8酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）；MLS-3780滅菌鍋（日本Sanyo公司）；無菌檢查薄膜過濾器（浙江寧海白石藥檢儀器廠）；生物安全柜（新加坡Esco公司）。

1.2 培養基和試劑

營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、0.7%蛋白胨水、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴代十六烷三甲銨瓊脂培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基均為北京三藥科技開發公司產品。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由中國醫學微生物菌種保藏管理中心提供。

1.4 藥品

克霉唑乳膏：來源于廣東順峰藥業有限公司、浙江盛基藥業有限公司、天津藥業集團新鄭股份有限公司、蕪湖三益制藥有限公司、廣州白云山制藥股份有限公司白云山何濟公制藥廠（以下簡稱何濟公制藥廠）等國內生產企業共276批樣品，規格有1%、3%2種，具體情況詳見表1（批號略）。

表1 樣品來源、規格及批次Tab 1 Source，specification and batch number of samples

2 方法與結果

參照2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法試驗[1]。

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，23～28℃培養5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫；吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備

取樣品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液70 mL，混勻，加30 mL無菌吐溫-80，混勻，加入30 mL十四烷酸異丙酯萃取，取下層作為1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數檢查方法的建立及驗證

2.3.1 計數檢查方法。①培養基稀釋法：取不同量供試液（1∶10）注皿，每皿分別加入1 mL驗證菌菌液，注入15～20 mL不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，凝固，培養。如每皿注入0.5 mL，則為1∶20稀釋。

②薄膜過濾法：取1∶10供試液1 mL，加入100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，采用薄膜過濾法處理，0.9%無菌氯化鈉溶液300 mL沖洗（每膜）。

2.3.2 敏感菌株及方法篩選。選取1批克霉唑乳膏按培養基稀釋法進行試驗，進行驗證敏感菌株初步篩選。培養基稀釋法（每皿0.5 mL）、薄膜過濾法加菌回收率試驗結果見表2。

表2 2種方法回收率試驗結果Tab 2 Results of 2 kinds of recovery tests

采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL），結果3株細菌驗證菌回收率均達到要求（大于70%）；白色念珠菌回收率為0，黑曲霉大于70%。由此表明：①克霉唑對白色念珠菌有很強的抑制作用，為5種驗證菌中對克霉唑最敏感菌株，方法篩選可采用該菌株進行；②培養基稀釋法即可消除克霉唑對細菌的抑制作用，初步確定細菌計數可采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL）；③以白色念珠菌為試驗菌，對薄膜過濾法進行初步驗證，結果回收率為97%，表明薄膜過濾法可消除克霉唑對白色念珠菌的抑制作用，初步確定霉菌和酵母菌計數可采用薄膜過濾法進行。

2.3.3 方法驗證。以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為驗證菌，選取國內13家生產企業的各1批克霉唑乳膏為樣品，對初步確定的細菌、霉菌和酵母菌計數測定方法進行驗證，結果見表3。

表3 13家生產企業產品計數方法驗證結果Tab 3 Validation result of determination method for products from 13 manufacturers

表3結果表明，13個不同廠家樣品，細菌代表菌株金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL），回收率均大于70%；霉菌和酵母菌代表菌株白色念珠菌采用薄膜過濾法，回收率均大于70%。因此，克霉唑乳膏細菌計數方法采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計數方法采用薄膜過濾法（沖洗量每膜300 mL）可滿足要求。

2.4 控制菌檢查方法的建立及驗證

（1）常規法：分別取1∶10的供試液10 mL，加入100 mL營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基中，分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌10～100 cfu，35℃培養24～48 h。取培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板，35℃培養24～48 h，觀察其菌落形態。

（2）培養基稀釋法：培養基用量為300 mL，其他同常規法。

另取大腸埃希菌作為陰性對照試驗菌。控制菌驗證試驗結果見表4（表中“/”表示未做）。

表4 控制菌驗證試驗結果Tab 4 Validation result of determination method for pathogenic bacteria

表4結果表明，采用常規法（培養基用量100 mL）進行銅綠假單胞菌檢查方法成立。克霉唑乳膏對金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，需采用培養基稀釋法（培養基用量300 mL）進行。

2.5 樣品微生物限度檢查

根據驗證結果，確定細菌計數采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計數采用薄膜過濾法（沖洗量300 mL），金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋法（培養基用量300 mL），銅綠假單胞菌采用常規法（培養基用量100 mL），對276批國產克霉唑乳膏進行微生物限度檢查，結果見表5。

表5 276批樣品微生物限度檢查結果Tab 5 Results of microbial limit test of 276 batches of samples

由表5可見，對276批克霉唑乳膏進行微生物限度檢查，結果合格率99.3%；有2批樣品不合格，均為細菌計數不合格。

3 討論

3.1 供試液處理

對于部分乳膏、栓劑等非水溶性供試品，需采用吐溫、十四烷酸異丙酯等進行乳化、萃取前處理，以分離乳膏基質和藥用成分，提取污染菌，供試液制備過程相對復雜[2，3]。克霉唑乳膏基質對供試品前處理影響較大，在制備供試液過程中，采用了吐溫-80作為表面活性劑、十四烷酸異丙酯對樣品進行萃取以分離基質和藥用成分、提取污染菌。由于各廠家處方、工藝的差異，不同廠家產品處理過程中，乳膏基質的除去難易不等，一些樣品較容易實現分離提取，一些樣品則需要加熱才能有效溶解萃取；在進行薄膜過濾時，一些樣品提取液仍堵塞濾膜，需減少每膜上樣量或進行多次提取。

3.2 標準的建立設想

經對不同廠家的克霉唑乳膏檢查方法進行驗證，表明細菌計數采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL）、霉菌和酵母菌計數采用薄膜過濾法（沖洗量每膜300 mL）、控制菌金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋法（培養基用量300 mL）、銅綠假單胞菌采用常規法（培養基用量300 mL）檢驗均能滿足2005年版《中國藥典》對微生物限度檢查方法的要求。由于克霉唑乳膏具有抗菌作用，其微生物限度檢驗方法如果不收入各論，則不同實驗室進行該品種均要對方法進行研究，易造成各實驗室檢驗方法的差異以及不必要的重復工作。此次研究所建立的方法經過國內各廠家產品的驗證，具有良好的通用性，建議考慮收入克霉唑乳膏標準正文。

3.3 克霉唑乳膏微生物限度檢查結果分析

3.3.1 整體情況。采用建立的微生物限度檢驗方法對抽驗的276批樣品進行檢驗，結果2批樣品不合格，均為細菌計數超過規定限度，不合格率為0.7%。

3.3.2 樣品的真菌污染。雖然克霉唑乳膏為抗真菌藥，但樣品檢驗結果顯示，部分樣品存在不同程度的真菌污染，其中一些樣品真菌污染較為嚴重，測定結果接近限度規定。樣品中檢出的真菌類型基本為霉菌，從形態上分析主要有青霉、根霉、毛霉等。提示雖然克霉唑具廣譜抗真菌活性，但也不可能殺滅所有真菌，對一些真菌沒有殺菌作用或者僅為暫時的抑制作用，如果生產過程各個環節不嚴格控制，都會造成產品的真菌污染。克霉唑乳膏為治療真菌感染的外用藥，如果產品本身即存在較嚴重的真菌污染，給用藥者會帶來二次感染的風險。

3.3.3 樣品的細菌感染。部分克霉唑乳膏存在細菌污染，細菌數標準規定限度為不得超過1 000個/g[1]，而有2批不合格樣品細菌數分別為1 100 000、820 000個/g，嚴重超標。

對2批不合格樣品的檢出菌進行分離鑒定，結果顯示，2個樣品均為單一菌污染。分離得到的菌株分別采用涂片鏡檢、生化鑒定、分子生物學基因分型分析。結果，上述2批樣品污染菌均為洋蔥霍爾德菌。該菌為呼吸系統疾病的致病菌，感染性強、危害風險較大。2批不合格樣品為同一廠家產品，檢出菌鑒定顯示2批產品為相同微生物污染，提示該企業生產環節可能存在系統的污染來源。

3.3.4 嚴格控制微生物污染。由于克霉唑乳膏基質相對較適合微生物存活，且效期較長，在產品生產過程中帶入的微生物污染，在產品貯存、流通過程中，如果有適宜條件，一些特定微生物可能會大量繁殖，給用藥者帶來危害。因此，必須嚴格控制產品的微生物污染。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：236、附錄93-98.

[2] 王 進.環吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法研究[J].中國藥房，2008，19（28）：2 216.

[3] 盧文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法學驗證[J].海峽藥學，2009，21（9）：48.