大粒徑纖維素衍生物手性固定相合成及對普萘洛爾的手性拆分研究

楊沛，王榮，馬駿，謝華，張軍莉，賈正平#，武曉玉，王娟（.蘭州軍區蘭州總醫院藥理基地，蘭州市 730050；2.蘭州大學藥學院，蘭州市 730000）

隨著對映體化學研究的不斷深入，人們越來越認識到手性化合物在醫藥、農藥及其他生物功能材料方面的重要作用[1]。對映異構體的手性拆分是獲得光學純物質的有效手段，手性高效液相色譜（Chiral HPLC）是近年來迅速發展起來的手性拆分方法，在藥物、天然產物和不對稱合成等研究領域應用前景廣闊[2，3]。手性HPLC的核心是手性固定相，其中由Kubota等[4，5]發展起來的多糖衍生物類手性固定相，通用性強、經久耐用、樣品載荷量大[6]，被廣泛地用于各種類型外消旋化合物的分析或制備拆分中[7]。

在多糖衍生物類手性固定相中，纖維素苯基氨基甲酸酯類衍生物特別是纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）對很多手性化合物都有極好的手性拆分能力[6]。Okamoto等[8]曾用CDMPC對510個消旋體進行手性拆分，其中229個完全拆分，86個部分拆分。雖然此類手性色譜柱已商品化，但商品化的手性色譜柱均采用小粒徑硅膠（5、10μm）為基質，雖然柱效高、分離效果好，但柱壓較高且價格昂貴，不適用于對映體的制備分離。而采用大粒徑硅膠（40～60μm）作為填料基質，雖然柱效有所下降，但卻克服了以小粒徑硅膠作為填料基質成本高、柱壓高的缺點，在手性制備柱的應用上顯示了很好的前景。因此，本研究以分離制備手性對映異構體為研究目的，為降低運行成本，合成了大粒徑涂敷型CDMPC手性固定相。并根據此類固定相適合于分離胺、醇、醚及其衍生物的性質[9]，選擇了結構中含有羥基、氨基及醚鍵的普萘洛爾作為評價對象，通過對普萘洛爾對映體的分離評價了合成的大粒徑涂敷型CDMPC手性固定相的手性拆分性能，并探討了大粒徑手性固定相的拆分機制，為進一步開發低成本的分析及半制備手性固定相奠定基礎。

普萘洛爾化學結構式見圖1。

圖1 普萘洛爾化學結構式Fig 1 Chemical structure of propranolol

1 儀器與試藥

1.1 儀器

NEXUS 670傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；Vario EL元素分析儀（德國Elementar Analysensysteme GmbH公司）；液相色譜系統，包括LC-6A泵、SPD-6AV紫外檢測器（日本Shimadzu公司）；分析之星色譜工作站（天津奧特賽斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

硅膠（粒徑40～60 μm）、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3，5-二甲基苯基異氰酸酯（美國Acros Organics公司）；微晶纖維素（以下簡稱纖維素，上海恒信化學試劑有限公司）；普萘洛爾標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100783-200401，純度：≥99.9%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備

精密稱取普萘洛爾標準品2 mg至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 手性色譜柱的制備

2.2.1 氨丙基烷化硅膠（APS）的合成。APS的合成參考文獻[10]，取硅膠50.08 g經鹽酸活化后，置于1 000 mL三頸瓶中，180℃下真空干燥5 h，得活化硅膠。在N2保護下，加入500 mL無水苯（經CaH2干燥）和9 mL無水吡啶（經CaH2干燥），再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷13 mL，80℃下回流反應24 h（電磁攪拌），冷卻后，分別依次用適量的甲醇、丙酮、正己烷清洗，60℃下真空干燥5 h，產物置于干燥器中備用。合成反應見圖2。

圖2 APS合成示意圖Fig 2 Synthesis diagram ofAPS

2.2.2 CDMPC的合成。參照文獻[11]將3.05 g纖維素置于500 mL三頸瓶中，90℃下真空干燥5 h。在N2保護下，加入120 mL吡啶，加熱回流24 h后，再加入30 mL 3，5-二甲基苯基異氰酸酯；100℃下油浴反應48 h（電磁攪拌），冷卻至室溫，劇烈攪拌下加入大量甲醇，抽濾，得灰白色固體，再用適量的甲醇洗滌后，60℃下真空干燥24 h，得灰白色固體9.73 g，產率85.78%。合成路線見圖3。

圖3 CDMPC合成示意圖Fig 3 Synthesis diagram of CDMPC

2.2.3 手性固定相的涂敷。取8.02 g CDMPC溶于400 mL四氫呋喃中，過夜后取出100 mL，加入到40 g APS中，磁力攪拌20 min使其分散均勻，真空旋轉緩慢蒸發除去溶劑，此過程重復4次，最終得到以APS質量計算涂敷量約為20%（W/W）的手性固定相。

取所得固定相3 g，以正己烷-異丙醇（90∶10，V/V）為勻漿液和頂替液，于約32 MPa壓力下裝入不銹鋼管（150 mm×4.6 mm）中。

2.3 手性固定相的表征

為考察大粒徑手性固定相合成時每步反應的鍵合情況，采用元素分析、紅外光譜對其相關參數進行考察。

2.3.1 APS的元素分析。對硅膠及APS進行元素分析，結果為硅膠中氮元素（N）的質量分數W（N）為0%，APS中W（N）為1.25%。從數據看出硅膠上無氮元素，而APS的元素分析結果中含有氮元素，說明3-氨丙基三乙氧基硅烷已鍵合到硅羥基上。

2.3.2 CDMPC的元素分析和紅外光譜分析。纖維素被酯化的程度對CDMPC手性固定相的手性識別能力有直接影響，酯化反應越完全，固定相的手性識別能力越高。

CDMPC的碳（C）、氫（H）、氮元素分析結果[實測值（理論值）]為：W（C）[66.01%（65.66%）]，W（H）[6.42%（6.18%）]，W（N）[6.67%（6.98%）]，實測值與理論值吻合較好，說明纖維素的酯化較完全。

再比較纖維素和CDMPC的紅外光譜圖，詳見圖4。

圖4 紅外光譜圖Fig 4 IR spectrum

由圖4可見，纖維素在3 346.1 cm－1處—OH的吸收很強，而CDMPC在此處—OH的吸收峰已經很弱，說明纖維素上的羥基已基本被酯化；同時在圖4B中，1 724.3 cm－1出現苯基氨基甲酰基的—CO吸收峰，1 615.2、1 559.7 cm－1是苯環的骨架結構，由此說明纖維素上的—OH已基本被3，5-二甲基苯基異氰酸酯酯化。

2.3.3 CDMPC手性固定相的元素分析。按“2.2.3”項下涂敷的質量分數為20%的CDMPC手性固定相的元素分析結果為：W（C）15.55%，W（H）2.13%，W（N）2.14%。而通過理論計算當涂敷量為20%時，CDMPC手性固定相中W（N）的理論值應為2.15%，與實測值吻合較好，說明CDMPC已按20%的涂敷量涂敷于APS上。

2.4 手性拆分性能評價

以普萘洛爾為對象，以合成的CDMPC手性固定相為手性柱，通過對色譜條件的優化，評價在最優的色譜條件下，手性柱的手性拆分性能。

2.4.1 色譜條件。色譜條件：色譜柱：自制的大粒徑CDMPC手性色譜柱（150 mm×4.6 mm，40～60μm）；流動相：正己烷-異丙醇-三乙胺（不同比例）；紫外檢測波長：276 nm；流速：0.3、0.5、0.7、0.9 mL·min－1；進樣量：20 μL；分離均在室溫下進行；色譜柱的死時間（t0）用1，3，5-三叔丁基苯測定。

2.4.2 流動相比例的優化。在涂敷型纖維素衍生物類手性固定相中，通常采用正己烷、異丙醇的正相流動相系統，而普萘洛爾為堿性藥物，在流動相中添加適當的堿性溶液有利于其分離和改善峰形。因此，本試驗考察了堿性添加劑三乙胺濃度為0.1%時，流動相中正己烷、異丙醇的不同比例對普萘洛爾手性拆分的影響，以2個對映體的保留時間tR1和tR2及根據公式k1'＝（tR1－t0）/t0、k2'＝（tR2－t0）/t0而得的2 個對映體的容量因子k'、分離因子α和分離度Rs為指標確定最優的流動相組成比例，考察結果詳見表1。

由表1顯示，隨著流動相中異丙醇比例的減少，容量因子k'均變大，表明樣品在手性固定相中的保留時間延長；同時分離度增加，表明異丙醇質量比例的減少有利于樣品得到更佳的分離效果；分離因子α隨之增加，表明固定相對樣品對映體的分離效果不斷增強。

綜合考慮分析時間和分離效果，確定正己烷-異丙醇-三乙胺（95∶5∶0.1，V/V/V）為最佳流動相組成比例。

表1 流動相中正己烷、異丙醇的不同比例對分離的影響Tab 1 Effect of different proportions of n-hexane and isopropanol in mobile phase on separation

2.4.3 流速的優化。考察了流動相流速分別為0.3、0.5、0.7、0.9 mL·min－1時對分離的影響，結果，流速與分離度間的關系見圖5。

圖5 流速對普萘洛爾分離度的影響Fig 5 Effect of flow rate on separation rate of propranolol

由圖5可見，流速從0.9 mL·min－1減小到0.5 mL·min－1時，分離度增大，達到基線分離。這是由于對映體在纖維素衍生物上的手性識別作用能量差極小，對映體間的完全分離有賴于溶質與固定相之間的多次相互作用。流速從0.5 mL·min－1減小到0.3 mL·min－1時，雖然分離度有所增加，但色譜峰加寬，分析時間延長，柱壓上升。綜合考慮分離效果、分析時間和柱壓等各方面因素，選擇0.5 mL·min－1為較適宜流速。

通過對流動相、流速的優化，最后確定了普奈洛爾分離的流動相為正己烷-異丙醇-三乙胺＝95∶5∶0.1（V/V/V，使用前均經0.22 μm 濾膜過濾并超聲脫氣15 min），流速為0.5 mL·min－1。2.4.4 樣品拆分。此條件下樣品的手性拆分色譜見圖6（其中，2個對映體的確定是通過旋光儀測定區分）。

圖6 普萘洛爾的手性拆分圖譜Fig 6 Chromatogram of chiral separation of propranolol

2.5 手性柱的穩定性

將所制備的CDMPC手性柱在正相條件下連續使用2個月（約450 h），共進樣約900針，考察柱壓和分離度的變化。結果，柱壓由386 psi變為435 psi，變化率為12.7%，表明柱壓值一直較低且無明顯升高；分離度由1.67變為1.62，分離度下降了2.99%，表明手性拆分能力及柱效均無明顯下降現象，這說明制備的CDMPC手性柱具有良好的穩定性。

2.6 CDMPC拆分普萘洛爾的機制分析

由于CDMPC手性固定相是具有左旋三重（3/2）螺旋型空穴的光學活性分子，3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯基團圍繞纖維素主鏈形成許多手性空腔，在手性空腔中，靠近纖維素主鏈的外側是芳基，內側是手性固定相的氨基甲酸酯殘基，對手性化合物有很好的選擇性。此外，纖維素類固定相的螺旋型空穴對進入空腔的芳環部分有很高的親和力，形成“立體配合”的包結作用[12]。普萘洛爾手性中心附近含有羥基和氨基，當其調整構象進入螺旋槽中，其結構中的羥基和氨基可與CDMPC酰胺鍵產生氫鍵作用，萘環與CDMPC中的苯環存在π-π作用，甲基與CDMPC中的甲基形成范德華力，從而與固定相形成締合物，由于2個對映異構體所形成的締合物的穩定性不同而達到手性分離。普萘洛爾在CDMPC手性凹槽內的超分子鍵聯示意圖見圖7。

圖7 普萘洛爾在CDMPC手性凹槽內的超分子鍵聯示意圖Fig 7 Diagram of supra-molecular bindings of propranolol in chiral groove of CDMPC

由圖7顯示，普萘洛爾能與CDMPC形成3個π-π作用、2個氫鍵作用和1個范德華力，從而使普萘洛爾在此固定相上獲得了較好的手性拆分[13]。

3 討論

纖維素衍生物類手性固定相由于其拆分的手性化合物范圍廣，樣品載樣量大，非常適合于手性藥物的制備分離。但由于常規的小粒徑（5μm）手性柱存在柱壓高、易堵塞、壽命較短等缺點，限制了其在制備分離上的應用。因此，本文采用大粒徑硅膠顆粒（40～60μm）制備了涂敷型CDMPC約45 g，達到半制備色譜柱所需的填料要求。將3 g該填料裝填在不銹鋼管中獲得涂敷型CDMPC手性分析柱，并通過對普萘洛爾對映體的分離評價了其手性拆分性能。結果在正相條件下普萘洛爾對映體的分離度達1.67，表明合成的CDMPC填料具有良好的手性拆分性能。

通過以大粒徑硅膠顆粒為填料基質，不僅降低了小粒徑手性柱制備中硅膠基質的原料費用，同時，由于填料孔徑大、填料間的空隙大，減小了對流動相的阻力，因此有效地避免了小粒徑手性柱柱壓高、易堵塞等缺點，在制備纖維素類手性柱的應用上顯示出了更大的優勢，在手性藥物的制備分離上顯示了很好的應用前景。

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