利塞膦酸鈉片溶出度測(cè)定方法的建立

李朋梅，張明，張鐳，劉曉，張相林#（.中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京市0009；.北京韓美藥品有限公司，北京市 03）

利塞膦酸鈉（Risedronate sodium）用于治療骨質(zhì)疏松，可有效抑制骨吸收、改善骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，效果良好[1]。與其他雙膦酸鹽類藥物相比，利塞膦酸鈉具有高效、安全、服用劑量小等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景[2]。目前國(guó)內(nèi)尚未見利塞膦酸鈉片溶出度分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)首次建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定利塞膦酸鈉片濃度從而計(jì)算溶出度的方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法完全適用于利塞膦酸鈉片的溶出度測(cè)定。

1 儀器與試藥

Agillent 1100液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

國(guó)產(chǎn)利塞膦酸鈉片（北京韓美藥品有限公司，批號(hào)：100601、100602、100603，規(guī)格：每片 5 mg）；進(jìn)口利塞膦酸鈉片（法國(guó)賽諾菲-安萬(wàn)特公司，批號(hào)：C001，規(guī)格：每片5 mg）；利塞膦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100613-200401，含量：88.2%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shiseido C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：緩沖液（含5 mmol·L－1磷酸二氫銨、2 mmol·L－1四丁基溴化銨、1.5 mmol·L－1乙二胺四乙酸二鈉，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2）-甲醇（75∶25，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：100 μL。理論板數(shù)按利塞膦酸鈉峰計(jì)不低于4 000。取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液及溶劑（水）進(jìn)樣分析，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

精密稱取利塞膦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水稀釋成每1 mL含10 μg的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取供試品6片，分別投入6個(gè)溶出杯內(nèi)，按規(guī)定的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)溶出儀，計(jì)時(shí)，按溶出度測(cè)定法（2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄第二法）[3]，以水500 mL為溶劑，轉(zhuǎn)速50 r·min－1，水溫（37.5±0.5）℃依法操作，經(jīng)30 min時(shí)，取溶液10 mL，過(guò)濾，去除初濾液3 mL，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

稱取利塞膦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解成20 mg·L－1的溶液，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度。因標(biāo)準(zhǔn)品溶液在262 nm有最大吸收，故選擇262 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取利塞膦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品20.69 mg，加水制成103.45 mg·L－1的貯備液，分別移取1.0、5.0 mL置于100 mL容量瓶中，另取1.0、2.0、3.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加水制成每1 mL含利塞膦酸鈉1.03、5.17、10.35、20.69、31.04、51.73 μg的溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，以利塞膦酸鈉濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝63.027c－0.737 7（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，利塞膦酸鈉檢測(cè)濃度線性范圍為1.03～51.73 μg·mL－1。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別制備含利塞膦酸鈉8.62、10.35、12.13 μg·mL－1的溶液，于同日內(nèi)（5次）、連續(xù)5 d每日精密量取100 μL溶液進(jìn)樣，記錄色譜，計(jì)算峰面積及日內(nèi)RSD和日間RSD。結(jié)果日內(nèi)RSD分別為0.16%、0.21%、0.22%，日間RSD分別為0.45%、0.53%、0.38%，表明測(cè)定方法的精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為10.56 μg·mL－1的供試品溶液在室溫放置，分別于制備后的 0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果 RSD 為0.29%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取利塞膦酸鈉16、20、24 mg，各3份，置于100 mL容量瓶中，加入4片量輔料，加水溶解并稀釋至刻度，精密移取續(xù)濾液5 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。另取標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋成每1 mL中含10 μg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按外標(biāo)法計(jì)算含量及回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（sn＝9）

2.8 介質(zhì)的選擇

按照“2.10”項(xiàng)下方法操作，分別以水、0.1 mol·L－1鹽酸、pH6.8緩沖鹽溶液為溶出介質(zhì)，分別于5、10、15、30、45 min取樣10 mL，過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充等溫同體積的溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液100 μL，測(cè)定，計(jì)算累積溶出度（%），繪制溶出曲線。結(jié)果，利塞膦酸鈉在3種溶出介質(zhì)中的溶出行為沒(méi)有明顯差異，以簡(jiǎn)單方便為原則，選擇水為溶出介質(zhì)，具體數(shù)據(jù)詳見表2。

2.9 轉(zhuǎn)速的選擇

以水為溶出介質(zhì)進(jìn)行片劑溶出度測(cè)定，轉(zhuǎn)速分別選擇50、75、100 r·min－1，按照“2.10”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果，在3 種轉(zhuǎn)速下，利塞膦酸鈉片累積溶出度均無(wú)明顯差異，因此選擇轉(zhuǎn)速為50 r·min－1。

表2 利塞膦酸鈉片在3種介質(zhì)中的累積溶出度結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Accumulative dissolution of Risedronate sodium tablets in 3 kinds of medium（±s，n＝6）

表2 利塞膦酸鈉片在3種介質(zhì)中的累積溶出度結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Accumulative dissolution of Risedronate sodium tablets in 3 kinds of medium（±s，n＝6）

累積溶出度/%pH6.8緩沖鹽溶液78.4±1.9 95.2±1.3 98.3±1.7 100.0±2.3 101.6±0.8時(shí)間/min 5 10 15 30 45水84.8±1.4 93.9±2.1 96.8±0.9 98.7±1.2 99.4±2.7 0.1 mol·L－1鹽酸76.0±1.1 92.8±2.0 96.2±1.0 97.4±2.2 97.6±2.5

2.10 溶出度測(cè)定

以水500 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，水溫（37.5±0.5）℃，取利塞膦酸鈉片6片，分別放入溶出杯中，于5、10、15、30、45 min時(shí)取樣10 mL，過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充等溫同體積的溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液100 μL，測(cè)定，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度。結(jié)果，30 min時(shí)利塞膦酸鈉基本溶出完全，因此，確定溶出時(shí)間為30 min，限度為標(biāo)示量的80%。國(guó)家與進(jìn)口樣品溶出度數(shù)據(jù)比較詳見表3。

表3 國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口利塞膦酸鈉片累積溶出度結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Accumulative dissolution of domestic and imported Risedronate sodium tablet（s±s，n＝6）

表3 國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口利塞膦酸鈉片累積溶出度結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Accumulative dissolution of domestic and imported Risedronate sodium tablet（s±s，n＝6）

時(shí)間/min 5 10 15 30 45累積溶出度/%批號(hào)C001 81.0±0.7 90.7±1.9 94.8±2.1 98.9±1.7 100.2±1.9批號(hào)100601 79.5±1.2 91.9±0.9 95.7±1.8 98.3±2.1 100.5±0.8批號(hào)100602 81.0±1.5 92.3±2.2 98.0±1.0 98.3±1.7 97.8±2.6批號(hào)100603 82.4±1.2 96.7±0.7 97.1±1.9 98.1±1.4 102.9±1.6

3 討論

根據(jù)以上試驗(yàn)，確定利塞膦酸鈉片采用HPLC法測(cè)定濃度，水500 mL作為溶劑，溶出度測(cè)定方法為槳法，轉(zhuǎn)速50 r·min－1，溶出時(shí)間為30 min，限度為標(biāo)示量的80%。通過(guò)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、線性關(guān)系考察、溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)、介質(zhì)和轉(zhuǎn)速的選擇，結(jié)果表明，建立的溶出度測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確度高，可用于利塞膦酸鈉片溶出度的測(cè)定。

藥物的體外溶出度是評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)3批利塞膦酸鈉片溶出度與進(jìn)口的利塞膦酸鈉片在15 min之內(nèi)溶出度均大于85%，且15 min時(shí)，兩者平均累積溶出度的偏差小于±15%，根據(jù)溶出曲線相似性評(píng)價(jià)方法[4]，可以認(rèn)為兩者的溶出行為是基本相似的。但對(duì)于體外累積溶出度的比較，溶出曲線的相似性并不意味著生物等效，只是可在一定程度上預(yù)測(cè)生物等效性研究情況，提高生物等效性研究的成功率。因此，該制劑體內(nèi)溶出行為還有待人體生物利用度試驗(yàn)的驗(yàn)證。

[1] 郝衛(wèi)強(qiáng)，劉文英，狄 斌，等.高效液相色譜法測(cè)定利塞膦酸鈉片的含量[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（4）：286.

[2] Siris ES，Chines AA，Altman RD，et al.Risedronate in the treatment of Paget’s disease of bone：an open label，multicenter study[J].J Bone Miner Res，1998，13（6）：1 032.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄86.

[4] 謝沐風(fēng).溶出曲線相似性的評(píng)價(jià)方法[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（4）：308.