林可霉素利多卡因凝膠微生物限度檢查方法研究

楊淑先，趙新霞，牛坡（.河南省食品藥品檢驗所，鄭州市450003；.河南省人民醫(yī)院，鄭州市450003）

林可霉素利多卡因凝膠為外用半固體抗菌制劑，需要控制微生物限度。但由于該制劑中林可霉素為水溶性的抗菌成分，可抑制微生物的生長，因此，不能通過常規(guī)法進行該藥品的微生物限度檢查；另由于凝膠為水溶性的基質(zhì)，但具有一定的黏度，直接用薄膜過濾法也難以去除抗菌成分。因此，需建立合適的方法對該樣品進行微生物限度檢查。筆者通過反復(fù)探索，經(jīng)多次試驗，最終選用以0.05 mol·L－1的四硼酸鈉溶液[1]為稀釋劑，采用薄膜過濾法進行本品的微生物限度檢查。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法有效、可行，可用于林可霉素利多卡因凝膠微生物限度檢查。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000A集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；離心機（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；一次性使用薄膜過濾器（北京牛牛基因技術(shù)有限公司）；PYX-DHS細菌培養(yǎng)箱、MJ-160B霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]均來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基[2]

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備[3]

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，再用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1 mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液的制備[1]

取樣品10 g，加0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液（85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0）至100 mL，邊加邊研磨，使供試品充分乳化，作為1∶10供試品溶液。

2.3 回收率的計算[4]

試驗組的加菌回收率（%）＝[（試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%；稀釋劑對照組加菌回收率（%）＝（稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)）×100%。

2.4 細菌檢查方法的驗證

2.4.1 試驗組[5]。取1 mL 1∶10供試品溶液，注入500 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含50～100 cfu的試驗菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.4.2 菌液組[6]。取1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的試驗菌菌懸液，注入平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。測定所加的試驗菌數(shù)。

2.4.3 供試品對照組。取1 mL 1∶10供試品溶液，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.4.4 稀釋劑對照組。取0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液1 mL，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含50～100 cfu的試驗菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

上述各組培養(yǎng)后按規(guī)定方法計算菌落數(shù)，計算回收率；試驗平行3次。菌落計數(shù)結(jié)果見表1，回收率結(jié)果見表2，其中供試品對照組均為無菌生長（表1中菌落數(shù)為2個平皿的平均值）。

表1 菌落計數(shù)結(jié)果（cfu）Tab 1Results of colony coun（tcfu）

表2 回收率測定結(jié)果（%%）Tab 2Results of recovery tests（%%）

由表1、表2結(jié)果可知，3次試驗中細菌回收率均大于70%。

2.5 霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.5.1 試驗組。取1∶10供試品溶液和含50～100 cfu的試驗菌孢子懸液各1 mL，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

2.5.2 菌液組。取含菌數(shù)為50～100 cfu的試驗菌孢子懸液1 mL，注入平皿中，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。測定所加的試驗菌數(shù)。

2.5.3 供試品對照組。取1∶10供試品溶液1 mL，注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

2.5.4 稀釋劑對照組。取0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液和含50～100 cfu的試驗菌孢子懸液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

上述各組培養(yǎng)后按規(guī)定方法計算菌落數(shù)，計算回收率；試驗平行3次。菌落計數(shù)結(jié)果見表1，回收率結(jié)果見表2，其中供試品對照組均為無菌生長（表1中菌落數(shù)為2個平皿的平均值）。

由表1、表2結(jié)果可知，3次試驗中霉菌和酵母菌回收率均大于70%。

2.6 控制菌檢查方法的驗證[7]

因樣品為一般外用制劑，根據(jù)微生物限度要求，控制菌只做金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查。

2.6.1 試驗組。取1∶10供試品溶液10 mL，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含10～100 cfu的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜加至相應(yīng)的100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依相應(yīng)菌的檢查方法進行檢查。

2.6.2 陰性菌對照組。方法同“2.6.1”項，只是加入菌懸液換為大腸埃希菌。

菌檢結(jié)果見表3、表4（表中“+”表示菌生長，“-”表示未見菌生長）。

表3 銅綠假單胞菌控制菌驗證方法試驗結(jié)果Tab 3 Results of verification test for Pseudomonas aeruginosa

表4 金黃色葡萄球菌控制菌驗證方法試驗結(jié)果Tab 4 Results of verification test for Staphylococcus aureus

由表3、表4可見，試驗組結(jié)果均為陽性，陰性菌對照組結(jié)果均為陰性，表明方法可行，結(jié)果符合要求。

3 討論

（1）微生物限度檢查法的方法學(xué)驗證于2005年版《中國藥典》執(zhí)行以來，遇到了各種劑型的前處理問題，特別是具有抗菌活性的藥品，既要保證徹底除去抗菌物質(zhì)，又要注意所采用的方法對微生物的損傷程度[8]，因此，應(yīng)對所采用的必需的試劑進行方法學(xué)的驗證試驗，保證所采用的方法為有效的方法。

（2）本品含量測定時采用高效液相色譜法，其含量測定供試液處理時既要通過薄膜過濾進樣，又要保證林可霉素溶解完全通過濾膜。本試驗借鑒了這種處理方法，達到既可過濾、又能使林可霉素通過濾膜去除其抑菌作用的優(yōu)點，從而使微生物在薄膜上有效截留，并對四硼酸鈉溶液的pH值進行了控制，同時也證明在四硼酸鈉在本試驗使用量下對微生物無毒性。

（3）在微生物限度檢查中，對于必須采用薄膜過濾法的品種，最大的困難是過濾速度較慢，因為多數(shù)品種為非全溶性的品種，只能采取上清液進行過濾。本品雖然為水溶性凝膠，但因凝膠的黏度嚴重影響過濾速度，因此，在分散凝膠的同時，選擇直徑較大的濾器，也是解決問題的有效途徑；另外也可采用溫度不超過45℃的沖洗液，降低黏度，提高沖洗速度。

（4）在微生物限度檢查中，對于沒有合適檢查方法的品種，要充分了解供試品的本身特性及處方組成[9]，甚至要了解有抗菌活性物質(zhì)的抗菌譜，才有助于選擇有效的方法，減少篩選的步驟[10]。本品中的林可霉素為抗細菌類抗生素，對真菌的抑制作用較弱，因此霉菌、酵母菌檢查方法可直接試用常規(guī)法。細菌計數(shù)方法驗證時采用薄膜過濾法，所用的沖洗量筆者曾以300、500、800、1 000 mL進行研究驗證[11]，最后確定1 000 mL沖洗量可達到消除抑菌活性的作用，同時稀釋劑對照組菌回收率亦均超過70%。對于難過濾的品種，在過濾的同時進行振搖，有助于提高過濾速度。

（5）微生物限度檢查時所采用的處理措施必須保證對微生物無毒性，本文所采用的四硼酸鈉溶液（0.05 mol·L－1）經(jīng)驗證對微生物無毒性，可以作為前處理溶劑。

（6）對于抑菌活性較強的品種，又無理想的方法去除抑菌物質(zhì)，可以制備1∶20的供試液，降低抑菌物質(zhì)的濃度，增大接種體積，保證接種總量不變。但同時平皿培養(yǎng)基的量或者液體培養(yǎng)基的量應(yīng)相應(yīng)增加，以保證微生物的生長環(huán)境。

[1] 國家藥典委員會編.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)）[S].第2冊.2002：147.

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[3] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅪJ.

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