5-羥甲基糠醛與牛血清白蛋白相互作用的光譜特性研究Δ

張軼，楊麗娟，王倩倩，張金蓮，孫祥德#（1.新鄉醫學院醫學檢驗系，新鄉市453003；.新鄉醫學院藥學院，新鄉市 453003）

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl-2-furaldehyde，5-HMF）是葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產生的一種醛類化合物，廣泛存在于含有糖類物質的中藥材和食品中。研究[1]表明，5-HMF一方面具有神經毒性，對人體橫紋肌及器官組織有損害，但另一方面具有抗氧化、抗心肌缺血等對人體有益的作用[2]。因此，深入開展包括5-HMF與生物大分子相互作用等方面的研究，可為闡明相關中藥及復方制劑的藥理、毒理作用提供試驗依據。

生命體內普遍存在著競爭性反應，其中活性小分子與生物大分子的相互作用就是這種競爭反應的表現。這種相互作用使得血清白蛋白能與許多內源性和外源性物質結合，從而起著載體蛋白的運輸作用[3]。在生命科學的研究中，了解蛋白質與其他物質的結合特性等信息，可以有助于對疾病的診斷和治療提供有價值的信息。因此，關于小分子與大分子相互作用的研究一直是生命科學領域的研究熱點之一。其中藥物和蛋白質相互作用的機制研究近年來引起了廣泛關注[4～7]。

目前，人們對5-HMF研究多集中在其藥理毒理方面[8]，與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用尚未見報道。鑒于此，筆者運用熒光光譜法和紫外光譜法對5-HMF與BSA的結合機制進行了探討，計算了結合常數K和結合位點數n，并基于F?rster的能量轉移理論，計算了供體與受體間的距離，從而得到了5-HMF與BSA相互作用的若干信息，以期對全面了解5-HMF的體內過程提供更多的理論參考。

5-HMF化學結構式見圖1。

圖15 -HMF的化學結構式Fig 1 Chemical structure of 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FP-6500型熒光光譜儀、UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

BSA（美國Sigma公司，批號：D0009，純度：98.0%，使用時用緩沖溶液溶解制備成相應濃度）；5-HMF（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0298，純度：99.0%，使用時用緩沖溶液溶解制備成相應濃度）；磷酸鹽緩沖溶液（臨用前制備，內含0.5 mol·L－1NaCl，pH＝7.4）；試驗用水為二次蒸餾水；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 試驗設計

本試驗以熒光光譜和紫外光譜研究5-HMF與BSA相互作用的光譜特性，先測定二者作用后體系的熒光強度，根據Stern-Volmer方程和結合常數表達式求出猝滅速率常數、結合位點數和結合常數；通過熱力學參數分析二者的相互作用機制；當5-HMF和BSA的摩爾濃度為1∶1時，5-HMF的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜有重疊現象，按照F?rster能量轉移理論，計算重疊積分，求出5-HMF與BSA之間的結合距離r；測定5-HMF、BSA及二者作用后體系的紫外光譜，根據光譜的變化進一步證明二者之間的相互作用。

2.2 熒光光譜分析

移取2.0 mL BSA工作液（濃度為1×10－6mol·L－1）于1 cm石英池中，加入適量5-HMF溶液（濃度為1×10－4mol·L－1），制得5-HMF的最終濃度分別為0、0.25×10－6、0.5×10－6、1.0×10－6、1.5×10－6、2.0×10－6、2.5×10－6、3.0×10－6、3.5×10－6、4.0×10－6、4.5×10－6、5.5×10－6mol·L－1的各混合溶液（記為溶液1→12）。設定激發波長為278 nm，在300～450 nm波長范圍內分別掃描27℃和37℃時溶液的熒光光譜，并記錄346 nm波長處的熒光強度，繪制BSA的熒光猝滅圖。

取5-HMF和BSA的摩爾濃度為1∶1混合溶液（濃度均為1.0×10－6mol·L－1），分別進行紫外掃描和熒光掃描，對二者光譜重疊部分計算重疊積分。

2.3 紫外吸收光譜分析

移取2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液于1 cm比色皿中，加入20 μL 5-HMF溶液，其終濃度為1.0×10－6mol·L－1，體系混合均勻后，用上述磷酸鹽緩沖溶液作參比，分別掃描27℃時5-HMF在250～350 nm和300～450 nm波長范圍內的紫外吸收光譜，記錄吸光度。

移取2.0 mL BSA工作液（濃度為1.0×10－6mol·L－1）于1 cm比色皿中，加入 5-HMF溶液（濃度為1.0×10－4mol·L－1）適量，得5-HMF的最終濃度分別為0、2.0×10－6、4.0×10－6mol·L－1的混合溶液。用磷酸鹽緩沖溶液作參比，掃描27℃時溶液在250～350 nm波長范圍內的紫外吸收光譜，記錄吸光度。

3 結果與分析

3.1 5-HMF與BSA結合反應的熒光猝滅機制

BSA的熒光猝滅光譜圖（27℃）見圖2；混合溶液的紫外、熒光掃描光譜圖見圖3。

圖2 5-HMF對BSA的熒光猝滅光譜（27℃）Fig 2 Fluorescence quenching spectrum of BSA as 5-HMF is added at 27℃

圖3 5-HMF的吸收光譜與BSA的熒光發射光譜的重疊圖Fig 3 Spectral overlap of 5-HMF absorption spectrum with BSAfluorescence spectrum

從圖2中可看出，隨著5-HMF濃度的升高，BSA的熒光強度明顯減弱，表明BSA熒光發射峰出現了明顯的猝滅現象，可見，5-HMF對BSA有猝滅作用。

熒光猝滅機制主要有動態猝滅、靜態猝滅和非輻射能量轉移等。動態猝滅是由蛋白質激發態分子與藥物由于熱運動而發生碰撞引起的，其過程符合Stern-Volmer方程[9]：

式中，F0和F分別為BSA與5-HMF作用前、后的熒光發射強度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數（L·mol－1·s－1）；τ0為未加猝滅劑時熒光體的壽命，對于生物大分子，其值約為10－8s[10]；c為5-HMF濃度（mol·L－1）；KSV為Stern-Volmer常數（L·mol－1），可通過猝滅曲線斜率得到。分別測定27℃和37℃時5-HMF與BSA作用的熒光光譜。假設5-HMF對BSA的熒光猝滅屬于動態猝滅，以F0/F對c作Stern-Volmer曲線。根據KSV＝Kqτ0處理試驗數據，可分別求得不同溫度下的猝滅速率常數Kq，結果見表1。

由表1可見，5-HMF對BSA猝滅過程速率常數（Kq）遠大于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散猝滅常數2.0×1010L·mol－1·s－1[11]。因此動態猝滅不是BSA熒光猝滅的主要原因。而且隨溫度升高，BSA的KSV降低，說明5-HMF對BSA猝滅過程為靜態猝滅。

表1 結合反應常數和熱力學參數測定結果Tab 1 Binding constants and thermodynamic parameters

3.2 結合常數與結合位點數的計算

靜態猝滅是由蛋白質基態分子與藥物形成了不發射熒光的配合物引起。設藥物在蛋白質分子上有n1個相同且獨立的結合位點，則熒光強度與猝滅劑濃度的關系可由熒光分子與猝滅劑分子之間的結合常數表達式求出[11]。

式中，n1和K分別表示結合位點數和結合常數。計算結果見表1。

由表1可見n1約為1，說明1個BSA分子結合1個藥物分子。

3.3 5-HMF與BSA的能量轉移

按照F?rster能量轉移理論[12]：轉移效率E與給體-受體之間的結合距離r和臨界能量轉移距離R0有關。

式中，F′為能量給體和受體為1∶1時能量給體的熒光強度，F0′為未加入受體時給體的熒光強度，R0是能量轉移效率為50%時的臨界距離。

式中，F（λ）為熒光給體在波長λ處的熒光強度，ε（λ）則為受體在波長λ處的摩爾消光系數，Δλ為計算重疊積分時分割的波長跨度。將圖3中光譜重疊部分采用矩形分割法按式（5）得J＝1.11×10－13cm3·L·mol－1，根據式（4）得R0＝4.7 nm。由式（3）可得r＝5.6 nm。r＜7 nm說明二者之間發生了非輻射能量轉移[13]。

式中，K2為偶極空間取向因子（K2＝2/3），ΦD為給體（BSA）的光量子產率（ΦD＝0.118）；n2為介質折射指數（n2＝1.336），J為供體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜間的重疊積分，可表示為：

3.4 5-HMF與BSA的主要作用力的類型

藥物與生物大分子之間的結合力主要包括氫鍵、靜電引力、疏水作用力和范德華力等，不同藥物與蛋白質結合力的類型是不同的。當溫度變化不太大時，反應的標準焓ΔH可以看作常數，根據以下熱力學方程[11]：

式中，R為氣體常數，T為絕對溫度。通過結合常數，計算標準焓ΔH、自由能ΔG和標準熵ΔS，結果見表1。

結合表1數據再根據熱力學參數與作用力之間的關系可知，由于ΔH＞0、ΔS＞0，因此5-HMF與BSA之間主要靠疏水作用力結合[14]。

3.5 紫外吸收光譜

5-HMF及與BSA混合后紫外吸收光譜見圖4。

圖4 紫外吸收光譜圖Fig 4 UV absorption spectrum

從圖4可見，BSA在278 nm波長處有吸收峰，當加入5-HMF后，隨著藥物濃度從2.0×10－6mol·L－1增大到4.0×10－6mol·L－1，二者作用后吸光度升高，進一步證明5-HMF與BSA之間存在著相互作用，形成了復合物[5]。

4 討論

本研究結果表明，5-HMF對BSA的內源熒光具有較強猝滅作用，這種猝滅特征主要為靜態猝滅和非輻射能量轉移機制。從5-HMF與BSA的結合常數、結合位點、結合距離和熱力學參數等數據可知，二者主要靠疏水作用力相結合，因此，5-HMF可以BSA為載體進行貯存和運輸。

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