人腦多形性膠質(zhì)瘤細胞系BT325對5種抗腫瘤藥物敏感性的研究①

韓明，袁芳，董麗萍，師忠芳，袁輝，楊少華

神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤(簡稱“膠質(zhì)瘤”)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見而又最難治的腫瘤，手術(shù)后的有效化療是目前治療惡性膠質(zhì)瘤、延長患者生命的必要手段之一[1]。但是，由于膠質(zhì)瘤化療耐藥現(xiàn)象十分常見，化療效果并不理想，因此提高膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感性是膠質(zhì)瘤化療亟須解決的重要問題。BT325膠質(zhì)瘤細胞是我所80年代由1例人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤(WHOⅣ級)細胞培養(yǎng)建立的細胞系[2]，為國內(nèi)學(xué)者研究人腦膠質(zhì)瘤常用的細胞系之一[3-4]。但是，目前缺乏該細胞系對臨床常用抗腫瘤藥物敏感譜的研究，本實驗選用簡便、準(zhǔn)確性高的cell-countykit-8(CCK-8)法，檢測BT325膠質(zhì)瘤細胞對順鉑(cisplatin,DDP)、替尼泊甙(teniposide,VM26)、尼莫斯汀(nimustine,ACNU)、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)及長春新堿(vincristine,VCR)5種臨床常用抗腫瘤藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦多形性膠質(zhì)瘤細胞系BT325：北京市神經(jīng)外科研究所儲存。試劑與儀器：DMEM：GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；培養(yǎng)板：Costar公司；DDP：齊魯制藥有限公司；ACNU：日本三共株式會社；VM26：百時美施貴寶；TMZ：江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司；VCR：廣州明興制藥有限公司；CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Sunrise酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取液氮凍存的BT325膠質(zhì)瘤細胞，40℃～42℃水溫迅速融化后1000 r/min離心10 min，去上清，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打分散為細胞懸夜，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 細胞生長曲線測定 取已鋪滿BT325細胞的培養(yǎng)瓶，用終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化后吹打分散為單細胞，接種于24孔培養(yǎng)板，接種密度為5×104個/ml。按DMEM培養(yǎng)基中FBS的濃度將BT325細胞分為3組，分別為無血清組、10%FBS組、20%FBS組。每24小時取3孔進行細胞計數(shù)，連續(xù)6 d，以細胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細胞生長曲線，按Patterson公式計算細胞倍增時間為：

Td=tlg2/lg(Nt/No)

其中Td：倍增時間(h)；t：細胞數(shù)由No增至Nt所需的時間；No：接種時的細胞數(shù)；Nt：培養(yǎng)th后的細胞數(shù)。

1.4 GFAP免疫組化染色 BT325細胞丙酮固定，免疫組織化學(xué)染色。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，GFAP抗體稀釋濃度為1∶100，DAB顯色。

1.5 抗腫瘤藥物的敏感性實驗 用終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化BT325細胞，以5×104個/ml的密度接種于96孔板，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，每孔100μl，24 h后每孔分別加入10μl抗腫瘤藥物。每種藥物7個濃度，按照血漿峰濃度(plasma peak concentration,PPC)進行倍比稀釋，DDP、VM26、ACNU、TMZ及VCR的PPC分別為：2.5μg/ml，5 μg/ml，6.5 μg/ml，7 μg/ml及0.5 μg/ml。藥物作用72 h后，每孔加10μl CCK-8試劑，2 h后酶標(biāo)儀在492 nm處測吸光度(OD值)。

1.6 藥物抑制率計算

抑制率=[1-(As-Ab)/(Ac-Ab)]×%

As：實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑、抗腫瘤藥物)OD值；Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑、無抗腫瘤藥物)OD值；Ab：空白孔(無細胞和抗腫瘤藥物、有CCK-8試劑)OD值。

抑制率≥50%為敏感，抑制率≥70%為高度敏感，IR＜50%認為不敏感。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Origin統(tǒng)計學(xué)軟件波茲曼方程分析藥物的量效關(guān)系，計算IC50。應(yīng)用方差分析比較各組細胞倍增時間的差異。

2 結(jié)果

2.1 不同血清濃度培養(yǎng)的BT325膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)觀察及生長曲線 BT325膠質(zhì)瘤細胞貼壁生長，倒置相差顯微鏡下觀察，BT325細胞半透明，形態(tài)呈多形性，包括梭形、星形、多角形，折光性好，無血清組及10%FBS組BT325細胞生長狀態(tài)較好(圖1A、B)，而20%FBS組BT325細胞增殖過快，6 d時細胞因密度過大出現(xiàn)死亡(圖1C)。細胞生長曲線顯示接種第2天3組BT325細胞均進入對數(shù)生長期，第5天細胞增殖達到高峰，并且20%FBS組第6天出現(xiàn)細胞數(shù)量下降(圖2)。無血清、10%FBS及20%FBS組的BT325細胞倍增時間分別為：(25.63±1.93)h、(19.53±3.56)h、(18.83±3.69)h，方差分析顯示僅無血清組與20%FBS組差異有顯著性(P＜0.05)，其他組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 BT325細胞鑒定 GFAP免疫組化染色可見，BT325細胞呈陽性反應(yīng)，在胞漿內(nèi)可見褐色染色(圖1D)。

2.3 BT325膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感性 采用含10%FBS DMEM培養(yǎng)的BT325膠質(zhì)瘤細胞進行抗腫瘤藥物敏感性的測定。DDP對BT325膠質(zhì)瘤細胞抑制作用明顯，在0.625×PPC濃度時抑制率達到51.8%，在1.25×PPC濃度時抑制率達到75.1%，且呈劑量依賴性，IC50為0.560×PPC。VM26在與其他藥物相同的濃度梯度時對BT325膠質(zhì)瘤細胞抑制明顯，各濃度抑制率均在79%以上，未顯示出明確量效關(guān)系；進一步擴大藥物稀釋梯度后，VM26對BT325膠質(zhì)瘤細胞有明顯抑制作用，顯示出量效關(guān)系，IC50為0.063 PPC(圖3)。VCR對BT325膠質(zhì)瘤細胞有抑制作用，抑制率為(48.71±11.64)%～(52.68±8.03)%，與藥物濃度無關(guān)。ACNU及TMZ在所觀察的藥物劑量范圍內(nèi)抑制率均在34%以下，對BT325膠質(zhì)瘤細胞基本無抑制作用。見表1。

圖1 BT325膠質(zhì)瘤細胞生長狀況

圖2 BT325膠質(zhì)瘤細胞生長曲線

圖3 VM26對BT325膠質(zhì)瘤細胞的量效關(guān)系

表1 不同藥物對BT325膠質(zhì)瘤細胞的抑制率(%)

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤患者平均生存時間短，手術(shù)及放療都不能治愈，化療個體差異大，治療效果不十分理想[5]，因此研究膠質(zhì)瘤的耐藥機制對提高化療效果有重要的臨床意義。因膠質(zhì)瘤的手術(shù)標(biāo)本不易得到，培養(yǎng)有一定難度，應(yīng)用人源的腫瘤細胞系進行抗腫瘤藥物敏感性試驗及耐藥機制研究受到關(guān)注[6]。本所建立的人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤系BT325[2]，生物學(xué)性能穩(wěn)定，增殖快，細胞形態(tài)多樣，是研究腫瘤耐藥機制、篩選抗腫瘤藥物的理想靶細胞。由于膠質(zhì)瘤的耐藥機制復(fù)雜，本實驗觀察了BT325膠質(zhì)瘤細胞對5種臨床常用的、作用機制不同的抗腫瘤藥物敏感性，實驗結(jié)果表明，BT325細胞對DDP敏感，對VM26高度敏感，對ACNU、TMZ不敏感，VCR有抑制作用但無量效關(guān)系。該結(jié)果與我們用人腦膠質(zhì)瘤組織培養(yǎng)化療藥物敏感性檢測得到的結(jié)果及文獻報道相似[7-10]。

本實驗中應(yīng)用的抗腫瘤藥物按照作用機制可以分為3類：①藥物作用與DNA烷基化無關(guān)的DDP及VM26；②通過DNA烷基化損傷發(fā)揮作用的ACNU及TMZ；③作用于M期的周期特異性藥物VCR。DDP為金屬鉑的絡(luò)合物，是臨床治療實體瘤的重要藥物，與烷化劑形成的鏈間交聯(lián)不同，90%的鉑與DNA結(jié)合形成鏈內(nèi)交聯(lián)，阻止DNA合成，從而產(chǎn)生細胞毒性作用。VM26是拓撲異構(gòu)酶抑制劑，通過導(dǎo)致DNA雙鏈或單鏈破壞，使細胞阻滯于晚S期或早G2期，為細胞周期特異性藥物，不引起DNA烷基化。本實驗觀察到BT325細胞對DDP及VM26均敏感，從藥物的作用機制分析該敏感性與DNA烷基化無關(guān)。相反，ACNU及TMZ都是烷化劑類藥物，通過DNA烷基化損傷，形成DNA交聯(lián)，抑制DNA合成，引起細胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細胞死亡，是目前臨床上首選的膠質(zhì)瘤治療藥[11-12]。但是本實驗結(jié)果顯示BT325細胞對ACNU及TMZ都不敏感，提示該細胞系可能代表臨床部分患者對ACNU及TMZ治療不敏感的情況，可用于研究ACNU及TMZ的耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥性的方法。VCR是細胞周期特異性藥物，作用于有絲分裂的M期，干擾紡錘絲和微管蛋白的合成，使有絲分裂停止于中期，引起腫瘤細胞死亡。本實驗觀察到VCR對BT325細胞活性的抑制作用與藥物濃度無關(guān)，推測可能與本實驗檢測細胞群中處于M期細胞的數(shù)目固定有關(guān)。結(jié)果還提示臨床上應(yīng)用VCR時要考慮腫瘤細胞的細胞動力學(xué)特點，單獨增加VCR的劑量并不能提高療效。

作為一種新型的體外細胞活性檢測方法，CCK-8法比4-甲基偶氮唑鹽(MTT)法更具優(yōu)勢[13]。CCK-8試劑中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜量與活細胞的數(shù)量成正比，因此酶標(biāo)儀檢測得到的吸收度值與活細胞數(shù)量成正比。由于反應(yīng)生成物為水溶性甲臜，可直接進行比色，操作簡單，重復(fù)性好。而以往細胞活性檢測多用MTT法測定，反應(yīng)生成物非水溶性甲臜顆粒有溶解不完全、結(jié)果重復(fù)性較差等缺點，而且操作較繁瑣。目前CCK-8法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

值得一提的是，由于細胞培養(yǎng)基中血清濃度對培養(yǎng)細胞的生長、增殖影響較大，進行腫瘤細胞活性檢測時，一定要考慮該因素對檢測結(jié)果的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)20%FBS組，由于細胞增殖過快，接種第6天時BT325膠質(zhì)瘤細胞出現(xiàn)大量的死亡細胞，這些死亡細胞會干擾細胞活性的測定結(jié)果，因此選擇合適的FBS濃度也是保證細胞活性測定準(zhǔn)確的關(guān)鍵因素之一。

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