輸注表達VEGF的成纖維細胞和rAAV-VEGF基因對大鼠腦缺血保護作用的比較研究

邵林華， 孫青芳， 卞留貫， 陳亦華， 程振宇， 鄭 龍， 俞建華， 張晨冉， 顧呂偉

VEGF是一種促進血管形成和分化的重要調節因子，同時具有神經保護和神經營養的特性［1］，同時它是一種分泌性蛋白，即使少量表達也能取得理想的生物學效應，因此被認為是可減輕腦缺血損傷的潛在的治療方法［2］。但由于直接輸注外源性的細胞因子，有著半衰期短、劑量大、反復操作易感染的缺點;以質粒為載體的VEGF基因轉染效率一般又較低(通常小于1%)，此外，如果腦缺血梗死區的神經元和星形細胞損傷較為嚴重，即使轉染效率不低，也會導致蛋白合成障礙［3］，所以VEGF基因治療腦缺血很難在臨床實際工作中展開。如何使外源性VEGF高表達，就成了國內外研究的焦點。

受到國外學者將血管生長素-1和VEGF基因修飾的骨髓間充質干細胞移植入MACO大鼠模型用以治療腦缺血嘗試的啟發［4］，我們想到或許可以借移植細胞來解決腦缺血區域質粒轉染效率低下或轉染后蛋白表達低下的問題。由于成纖維細胞能分泌多種與血管形成有關的活性肽，移植后繼續生長、增殖，可能對移植處的血管化具有重要作用［5］。于是，本次實驗我們就擬通過比較定向移植輸注表達VEGF的成纖維細胞和原位注射rAAV-VEGF基因對大鼠腦缺血的療效，為如何進行VEGF基因治療急性腦缺血疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠30只，SPF級，體重250～350g，月齡10個月，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。每籠飼養6只，飼養室溫度控制在20℃ ～22℃ ，明暗光照每日各12h。隨機分為5組:(1)假手術組，切開左側旁正中皮膚，用直徑為0.265mm的尼龍線從頸外動脈(ECA)殘瑞插入約1cm到達頸內動脈(ICA)與翼腭動脈(PPA)分叉處，縫合皮下組織及皮膚后，放籠內精心飼養;(2)MCAO組，按Longa等［6］描述的大腦中動脈線栓閉塞法(MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血動脈閉塞;(3)移植輸注組;(4)直接注射組，都先按照上述方法制成MCAO，術后24h內，于大鼠前囟偏左5mm、向后3mm處鉆一小孔，用微量注射器進針約3.5mm，分3個注射點注入共100μl表達 VEGF的成纖維細胞(1.0×106cells/ml)或 rAAV-VEGF載體，病毒滴度均為2.0×1012vg(vector genomes)/ml;(5)正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-成纖維細胞的制備

1.2.1.1 重組腺相關病毒載體 rAAV-VEGF購自上海瑞鹿生物技術有限公司，均含有CMV啟動子。

1.2.1.2 成纖維細胞的制備 1個月齡SD大鼠后肢脫毛、消毒、取皮、去除皮下結締組織，PBS反復沖洗后剪成約0.5mm3，培養、傳代，實驗用第3～4代的細胞。

1.2.1.3 成纖維細胞的轉染和鑒定 感染前24h胰酶消化細胞，按1×105接種至6孔培養板中，待細胞約70%融合時轉染。加入病毒上清，轉染成纖維細胞，同時加入800μg/ml的polybrene，使其終濃度為16μg/ml，8h后換800μg/ml G418的新鮮液DMEN(10%FCS)進行篩選，直至陽性克隆出現。消化細胞，用Trizol試劑進行總RNA的抽提，用RTPCR法檢測VEGF的表達，VEGF引物序列上游:5’-GGTACCTCCGAAACCATGAACTTT-3’，下游:5’-GGATCCTTCATTTCAGGTTTCTGG-3’，目的片段大小為464bp。GAPDH作為內參，引物序列:上游5’-gcaagagagaggccctcag-3’，下游 5’-tgtgagggagatgctcagtg-3’，目的片段大小為205bp。

1.2.2 VEGF mRNA 檢測

1.2.2.1 腦組織總 RNA的抽提用Trizol試劑進行總RNA的抽提，使用ND-1000核酸蛋白測定儀(美國Nano Drop公司)測定RNA的濃度和質量，瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA抽提的質量。

1.2.2.2 逆轉錄和PCR擴增取2μg總RNA樣品，根據TAKARA RT-PCR一步法試劑盒的說明進行逆轉錄和PCR擴增，PCR反應條件為94℃預變性 5min;94℃45s、60℃45s、72℃1min，共 25 個循環;再72℃10min，4℃保存。擴增結束后取PCR產物上樣，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，應用凝膠成像系統對條帶進行掃描分析，根據各組樣本GAPDH內參的PCR產物條帶的灰度值進行標準化，再比較各組VEGF基因PCR產物的相對表達量。

1.2.3 免疫組織化學染色

1.2.3.1 標本制作 術后14d，各組大鼠均斷頭取腦，從額端向枕端連續做腦正中冠狀面切片，每片2mm，并迅速放入4%多聚甲醛固定液中，置4℃～6℃ 固定2d。常規脫水、石蠟包埋，8μm厚度切片。LDP法免疫組化染色。

1.2.3.2 操作步驟 石蠟切片常規脫蠟至水;用高壓鍋加熱法，0.01mol/L pH 6.0檸檬酸進行抗原修復;3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶15min;加第一抗體(VEGF)室溫30min，PBS洗3次;加第二抗體(EnVision-HRP)孵育30min，PBS洗3次;DAB顯色;蘇木素復染胞核;常規脫水、透明、封片。

1.2.3.3 陽性細胞計數 每個標本在梗死灶邊緣區或假手術組的皮質區各取10個視野統計VEGF免疫反應陽性細胞數，其均值即為該標本的陽性細胞數密度。

1.2.4 大鼠腦梗死的染色 術后14d，各組大鼠均斷頭取腦，取腦正中冠狀面，每片2mm，切下后迅即放入37℃ 的4%TTC溶液中染色30min。觀察各腦片首尾兩面的梗死情況。

1.2.5 統計學處理 采用 SPSS 12.0軟件包進行統計學分析，各組內數據用均數±標準差()表示，各組間差異顯著性的比較采用ANOVA方法，設定P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF表達的檢測 根據5組大鼠大腦樣本GAPDH內參的PCR產物條帶灰度值標準化后，比較各組VEGF基因PCR產物的相對表達量(見圖1)。結果發現:假手術組和正常對照組的VEGF表達量基本相同，移植輸注組和直接注射組的VEGF基因表達均明顯增高，但移植輸注組增高更顯著，而MCAO組VEGF基因的表達量較正常對照組低。

2.2 腦缺血邊緣區 VEGF陽性細胞檢測VEGF免疫組織化學染色的著色部位在細胞漿，呈黃褐色，即為VEGF陽性細胞。腦梗死后，缺血邊緣區會有較多的神經細胞和內皮細胞以及少量的膠質細胞表達VEGF蛋白;而正常腦組織中只有極少數的神經細胞、膠質細胞和內皮細胞表達。本次實驗中，直接注射組、移植輸注組中的VEGF蛋白表達水平顯著增強，MCAO組則較弱(見表1)。

2.3 大鼠缺血腦組織壞死情況 正常腦組織經TTC染色后呈均勻鮮紅色，而腦缺血后的梗死區則呈灰白色。正常對照組和假手術組基本相同，而MCAO組腦梗死體積百分比較大，直接注射組、移植輸注組和聯合治療組的腦梗死體積百分比明顯縮小，其中聯合治療組減小最明顯(見圖2)。

表1 各組大鼠腦缺血邊緣區VEGF陽性細胞密度

圖1 5組大鼠腦組織VEGF和GAPDH mRNA表達

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較

3 討論

目前，缺血性腦血管病的治療方法主要還是通過溶栓、抗凝、抗血小板聚集等，防治血栓和擴張血管等傳統方法來改善血液供應。創傷修復的現代概念認為，創傷修復是多種細胞、生長因子和細胞外基質之間相互作用的復雜的動態過程，成纖維細胞可以通過自分泌和旁分泌機制產生生長因子，作用于自身及其它細胞，調控修復過程，在整個修復過程中起著基礎與關鍵的作用［7］。VEGF是一種促進血管形成和分化的重要調節因子，同時具有神經保護和神經營養的特性，因此給予外源性VEGF被認為是可減輕腦缺血損傷的潛在的治療方法［8］。本次實驗把轉染了VEGF基因的成纖維細胞移植入腦進行缺血區域的治療。實驗結果顯示，正常對照組和假手術組大鼠的腦組織中有少量的血管內皮細胞表達VEGF;MCAO組大鼠的缺血腦組織尤其是缺血邊緣區的血管內皮細胞、神經細胞的VEGF表達增強，但增強的程度有限，可能僅是一種反應性的增強。而大鼠腦缺血后通過移植轉染VEGF基因的成纖維細胞和直接注射導入rAAV-VEGF后，缺血邊緣區的血管內皮細胞、神經細胞和膠質細胞的VEGF表達則顯著增強，表明導入的外源性VEGF基因能夠在缺血腦組織中表達出VEGF;此外，腦組織壞死情況也有減輕、腦梗死體積縮小，這提示導入的外源性VEGF能促進腦缺血邊緣區新生血管的形成和側支循環建立，通過改善腦血流進而保護神經元，達到減輕缺血性腦損傷的作用。移植轉染VEGF基因的成纖維細胞較直接注射rAAV-VEGF組的效果更為顯著，這可能與缺血區域的細胞功能受到不同程度的損傷從而影響了蛋白合成，而缺血部位移植的轉染VEGF基因的成纖維細胞未受此影響有關。但此治療手段效果與轉染效率和輸入細胞量有著明顯的關系;此外，對新生血管功能的評價等，都有待于進一步研究。

綜上所述，通過移植轉染VEGF基因的成纖維細胞治療腦缺血能夠取得良好的效果，可能會成為一種較為合適而有效的治療途徑。

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