依達拉奉對阿爾茨海默病模型大鼠認知損害的保護作用和腦內Bcl-2表達的影響

周珊珊， 劉麗娜， 馮連榮， 張黎明

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種年齡相關的進行性、獲得性神經系統退行性疾病，常表現為認知功能障礙、記憶力減退。AD作為老年癡呆的主要原因其病因尚不清楚，而且缺乏有效的預防和治療方法。隨著我國老齡化加劇，AD患病率逐年增加，AD的預防和治療已經成為一個重要的醫學和社會問題。目前研究認為AD的病理基礎包括老年斑形成、神經原纖維纏結、神經元缺失和膽堿能神經元變性等［1］。在眾多的AD病因假說中，自由基的產生被認為是一個十分重要的因素。大量研究證據表明機體自由基產生和抗氧化系統作用失衡產生的氧化應激在AD發病早期的神經損傷中起重要作用［2］。我們旨在通過ICV-STZ建立模型，應用新型自由基清除劑-依達拉奉進行干預，研究依達拉奉對AD模型大鼠腦內氧化應激和神經細胞凋亡的影響，初步探討依達拉奉對AD模型大鼠認知功能改善作用的機制，為AD的預防和藥物治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要試劑 雄性成年SD大鼠48只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重200～250g。按每組12只(6只用于生化檢測，6只用于免疫組化檢測)隨機分成4組:假手術組(S)、依達拉奉 +假手術組(E+S)、ICV-STZ組(L)、依達拉奉+ICV-STZ組(E+L)。依達拉奉(南京先聲東元制藥有限公司)，鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ，美國 Sigma公司)，SOD、MDA 檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(一抗，美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體(PV6001，二抗，北京中杉金橋公司)，3，3’-四鹽酸二氨基聯苯胺(DAB，北京中杉金橋公司)。

1.2 給藥方法 E+S組和E+L組大鼠每日分兩次腹腔注射依達拉奉3mg·kg－1，共14d。其余兩組每日腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 AD模型的建立 依達拉奉干預14d后依照文獻［3］的方法制模:大鼠10%水合氯醛3ml·kg－1腹腔注射麻醉，頭部固定于立體定位儀上，沿頭部正中線做矢狀切口，分離皮下組織暴露顱骨。取前囟后0.8mm，左右旁開1.5mm顱骨打孔，垂直深度3.6mm微量加樣器緩慢雙側腦室內注射STZ 3mg·kg－1。注入的STZ生理鹽水溶液體積控制在10μl左右，假手術組腦室內注射相應體積的生理鹽水。注射完畢用骨蠟封填顱骨缺損，縫合頭皮。48h后重復上述手術注藥過程。

1.4 Morris水迷宮評價認知功能 第一次腦室內注藥2w后行Morris水迷宮測試評價各組大鼠的學習記憶能力［4］。水迷宮的主要組成部分是一個直徑150cm，高60cm充滿水的圓形不銹鋼水池，水池分為4個象限，水池內壁呈黑色。逃逸平臺是一個透明的直徑為10cm的可移動圓柱形平臺，其表面距水面2cm。定向航行試驗:在測試中將平臺放置在任一象限，選擇某個象限將大鼠面朝池壁放入水中。大鼠到達平臺后令其在平臺停留30s，然后繼續下一次訓練，每次尋找平臺時間不超過120s。每天訓練4次，記錄大鼠每次到達平臺所用的時間，共訓練5d。空間探索試驗:第6天將水下平臺撤去，將大鼠放入水中自由游動120s，記錄大鼠在平臺所在目標象限停留的時間。

1.5 SOD和MDA檢測 認知功能評價后處死動物，迅速取腦，冷鹽水沖洗去除血液和雜質。分離海馬和皮質組織稱重，用生理鹽水分別制成10%組織勻漿。組織勻漿經4000g離心10min，取上清用于檢測。SOD和MDA的檢測嚴格按照試劑盒說明操作。

1.6 免疫組化檢測Bcl-2 認知功能評價后麻醉動物，經左心室插管，灌流生理鹽水和4%多聚甲醛。取腦，取視交叉前后2mm冠狀切片置于4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，經HE染色，光學顯微鏡觀察。采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)檢測石蠟包埋切片中Bcl-2的表達。方法如下:石蠟切片經常規處理，經內源性過氧化物酶阻斷和抗原修復后滴加兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(一抗)，4℃孵育過夜。次日滴加PV-6001(二抗)，室溫下孵育20min，經DAB顯色，脫水，透明，封片。采用“雙盲法”在光學顯微鏡下觀察。

1.7 統計學評價 Morris水迷宮評價和生化分析結果用均數±標準差表示。應用SPSS13.0統計軟件系統作數據處理分析，統計分析方法為單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05差異具有統計學意義。免疫組織化學結果判斷標準:在×400放大倍數下，每張切片隨機選取10個視野，胞漿或胞核染成棕黃色為陽性。陽性細胞著色判斷(A):＜5%為0分;5% ～25%為1分;26% ～50%為2分;＞50%為3分。陽性強度(B):無著色或與背景均勻一致的淡黃色為0分;淺棕黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。根據兩項指標的積分數(積分=A×B)進行計分，2～3分為弱陽性(+);4～6分為陽性();7～9分為強陽性()。

2 結果

2.1 認知功能評價 定向航行試驗中，隨著訓練時間延長各組大鼠的逃逸潛伏期均逐漸縮短。第5天各組大鼠逃逸潛伏期結果S組10.25±3.91，E+S組 13.65 ±4.24;L 組 77.71 ± 6.72，E+L 組29.08±4.52。L組比 S組潛伏期顯著延長(P＜0.05);E+L組比L組潛伏期顯著縮短(P＜0.05);S組與E+S組比較結果無統計學意義(P＞0.05)(見圖1)。空間探索試驗中，各組大鼠目標象限停留時間為 S組33.62 ±6.98，E+S組32.69 ±5.93;L組22.4 ±5.03，E+L 組32.89 ±6.21。L 組比 S組時間顯著減少(P＜0.05);E+L組比L組時間顯著增加(P＜0.05);S組與E+S組比較結果無統計學意義(P ＞0.05)(見圖2)。

2.2 SOD和MDA檢測 L組大鼠海馬和皮質SOD含量比S組顯著減少(P＜0.05);E+L組大鼠海馬和皮質SOD含量比L組顯著增加(P＜0.05)。L組大鼠海馬和皮質MDA含量比S組顯著增加(P＜0.05);E+L組大鼠海馬和皮質MDA含量比L組顯著減少(P＜0.05)。S組和E+S組的海馬和皮質SOD和MDA含量分別比較差異均無統計學意義(P ＞0.05)(見表1)。

2.3 Bcl-2免疫組化檢測結果 L組(42%)海馬的表達陽性率低于S組(92%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。E+L組(75%)海馬的表達陽性率高于 L組，差異有統計學意義(P＜0.05)。L組(33%)皮質的表達陽性率低于S組(92%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。E+L組(67%)皮質的表達陽性率高于L組，差異有統計學意義(P＜0.05)(見表2)(見圖3)。

表1 各組大鼠海馬和皮質SOD、MDA、GSH含量比較

表2 海馬齒狀回和皮質顆粒細胞不同組間Bcl-2表達

圖1 Morris水迷宮各組大鼠逃逸潛伏期比較

圖2 Morris水迷宮各組大鼠目標象限停留下時間比較

3 討論

氧化應激是包括AD在內的多種隨年齡進展和年齡相關的神經系統退行性疾病發生發展的重要原因［5］。氧自由基能夠引起蛋白質、脂質、糖類、核酸等生物活性分子的氧化修飾，使細胞原有的結構和功能喪失，使多種生物酶失活，最終引起細胞凋亡［6］。對抗氧化應激過程中，腦組織會代償性地加速Aβ生成［7］，氧化應激還可誘導 tau蛋白的磷酸化［8］。這些改變均能引起不同程度的神經損傷，引起認知功能的下降，促進AD的進展。

有研究表明ICV-STZ能夠引起大鼠學習記憶能力下降，其原因是大鼠腦內氧化應激增強、膽堿乙酰基轉移酶活性降低、能量代謝障礙和tau蛋白生成增加等［9］。本實驗觀察到ICV-STZ引起大鼠學習和記憶能力顯著下降，大鼠腦內SOD含量顯著下降，MDA的含量顯著增加。SOD是體內重要的抗氧化酶，能夠清除自由基，具有抗氧化應激損傷的作用。MDA是體內自由基對不飽和脂肪酸引發的脂質過氧化反應的分解產物，其含量的多少可間接反應脂質過氧化水平的高低和對細胞的損傷程度。本研究結果進一步證實ICV-STZ引起腦內氧化應激增強是大鼠認知功能下降的重要原因。

依達拉奉是一種新型強力自由基清除劑。在以往的研究中，依達拉奉做為一種神經保護劑常用于缺血和出血性腦血管病的治療，顯示了較好的療效。近年來，一些研究針對依達拉奉對非腦血管病的神經系統疾病的預防和治療作用進行了探索。Anuj等研究證明依達拉奉能夠改善糖尿病周圍神經病大鼠的神經傳導速度和坐骨神經的氧化應激水平［10］。最近有研究證明依達拉奉對PrP106-126損傷的PC12細胞有保護作用，進而推測依達拉奉可能對神經系統退行性疾病具有預防和治療作用［11］。本研究應用依達拉奉干預STZ誘導的AD模型大鼠，結果表明依達拉奉能夠顯著改善AD模型大鼠的認知功能，逆轉了STZ引發的大鼠腦內SOD減少和MDA增加。以往研究表明凋亡在AD的發生發展中起重要作用。凋亡的刺激因素包括氧化應激、能量代謝障礙、線粒體功能失調、Aβ沉積、DNA損傷等［12］。在AD患者的腦組織中已經發現Bcl-2家族和caspase家族凋亡相關蛋白表達嚴重失衡［13］。Bcl-2是抗凋亡蛋白的重要成員之一，Katare等發現依達拉奉能夠上調缺血再灌注損傷大鼠心肌組織的Bcl-2表達以對抗氧化應激損傷，減少細胞凋亡［14］。本研究中STZ誘導的AD模型組大鼠海馬和皮質腦組織Bcl-2表達顯著減少。依達拉奉預處理抑制了大鼠腦組織Bcl-2表達減少，從而減少了STZ誘發的神經細胞的凋亡。

目前，包括AD在內的多種神經退行性疾病尚無有效的預防和治療方法。依達拉奉作為一種新型自由基清除劑其對神經退行性疾病的防治作用正逐漸被人們認識。本研究結果提示依達拉奉能夠保護AD模型大鼠的認知功能損害，其作用可能是通過抑制氧化應激損傷、減少神經細胞凋亡實現的。該結果為自由基清除劑應用于AD等神經退行性疾病的防治提供了理論依據。然而，依達拉奉的這種保護作用是否存在其他的機制尚有待進一步研究。

圖3 海馬齒狀回和皮質顆粒細胞不同組間Bcl-2表達

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