溶血磷脂酸通過ERK1/2通道誘導在體海馬星形膠質細胞增殖

朱 揚， 張兆輝， 曾 偉， 高 延， 許澤武， 徐金梅

星形膠質細胞是腦組織中含量最多的一種細胞。近來研究發現正常生理條件下，星形膠質細胞對神經元起營養、支持和保護作用，而腦損傷可激發星形膠質細胞使其過度活化，釋放大量細胞因子，損傷神經元，同時過度增殖的膠質細胞形成膠質瘢痕阻礙了損傷后的修復以及神經元軸突再生，并明顯改變了局部正常結構及神經元的生存環境。溶血磷脂酸是一種新發現的細胞間磷脂類信號分子，是細胞存活、增殖及遷移的強有力的誘導因子。在急性缺血性心腦血管病、腦損傷時，血小板被凝血酶活化產生LPA并釋放到血清中，致使血清LPA水平大幅度增高，進而促進血腦屏障開放，引起神經元凋亡、壞死等多種損傷［1，2］，嚴重影響腦血管疾病的預后。而LPA受體主要在AST中表達，AST為LPA在腦內作用的主要靶細胞［3］。

因此，LPA與AST活化增殖的內在關系已開始引起部分學者的關注。近年大量離體實驗研究發現LPA能誘導AST增殖，但目前國內外相關在體研究較少，而有關海馬區域相關研究尚未見報道。

故本實驗擬通過觀察LPA對在體海馬AST的影響，從在體水平證實LPA誘導海馬AST增殖并探討其可能的作用機制，為急性缺血性腦血管病、腦損傷的理論及治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 立體定向儀、微量注射器、光學顯微鏡及手術器械等，溶血磷脂酸(Sigma公司)，U0126(Promega公司);小鼠來源磷酸化ERK1/2一抗、羅丹明標記羊抗小鼠IgG、FITC標記羊抗小鼠IgG、封閉用山羊血清(Santa Cruz公司);小鼠來源膠原纖維酸性蛋白一抗(Neo markers公司);封閉用小鼠血清(Boster公司);振蕩切片機，德國Leica公司產品;TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司產品。

1.2 實驗動物及分組 80只健康雄性SD大鼠，月齡2～3個月，體重200±25g，購于武漢大學醫學院實驗動物中心，并隨機分空白對照組5只、實驗對照組25只、LPA組25只、LPA+U0126組25只，其中實驗對照組、LPA組和LPA+U0126組分別于注射 PBS、LPA、LPA+U0126 后1d、3d、5d、7d、14d后處死，每個時間點5只。空白對照組不注射藥物，直接處死。

1.3 動物模型的制作 大鼠稱重，20%烏拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，取前囟右側2.15mm，后3.00mm處用牙科鉆鉆孔，骨孔直徑約1.0mm，自顱骨表面垂直進針3.00mm深;P組、L組、L+U組分別用緩慢注射推進器注射PBS5μl和50μmol LPA5μl以及 U0126和 LPA 混合液5μl(0.2μl/min)，注射完畢后針頭在腦內停留10min，緩慢退出。

1.4 切片制備 各組大鼠分別于術后不同時間點開胸，用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4)300ml進行心臟灌注，灌注完后取腦置于4%多聚甲醛中固定24h。沖洗腦組織，用振蕩切片機在含海馬區的腦組織連續冠狀切片(FREE=5，FREQ=5)，片厚50μm。

1.5 免疫熒光雙標記染色 切片置于多聚賴氨酸包被的玻片上，加入封閉液1，置37℃濕盒中1h;滴加1∶300的小鼠GFAP單克隆抗體，置4℃冰箱中過夜;滴加1∶100Rodamin標記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒1h;加入封閉液2，置37℃濕盒中1h;滴加1∶100小鼠 p-ERK單克隆抗體，置4℃濕盒中過夜;滴加1∶100FITC標記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒中1h;甘油封固，加蓋蓋玻片。采用TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡檢查。用單位面積平均熒光強度(Average FI)表示GFAP和p-ERK1/2表達水平。計算公式如下:Average FI=FI/area(μm2)×100000。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差±s)表示，各組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。分析結果用Excel辦公軟件制成圖表。

2 結果

2.1 各組GFAP熒光強度時程變化 空白對照組與實驗對照組GFAP單位面積平均熒光強度(Average FI)相當，無顯著差異(P＞0.05);LPA注射后第3天，可見GFAP顯著增加(約4倍于基礎強度)，此后隨時間延長，GFAP熒光強度逐漸增加，至LPA注射后2w仍可見增加說明星形膠質細胞增殖時間至少持續2w。U0126與LPA混合液注射后，GFAP單位面積平均熒光強度輕度增加(約2倍于基礎水平)，與實驗對照組無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 不同時間大鼠海馬區GFAP單位面積熒光強度(Average FI)值比較±s)

表1 不同時間大鼠海馬區GFAP單位面積熒光強度(Average FI)值比較±s)

與實驗對照組比較*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 LPA+U0126組比較△P ＜0.05

GFAP組別 鼠數(只)單位面積熒光強度1d 3d 5d 7d 14d空白對照組實驗對照組LPA組LPA+U0126組526.95 ±0.49117.27 ±1.24＊△65.34 ±1.1825252521.28 ±0.1920.00 ±0.4552.35 ±1.0934.82 ±0.5619.41 ±0.2679.00 ±0.79＊△49.15 ±0.7323.00 ±0.3491.14 ±1.12#△58.76 ±0.8424.00 ±0.1698.14 ±0.98＊△59.35 ±1.03

2.2 各組p-ERK磷酸化熒光強度變化 LPA注射后第5天誘導顯著的ERK 1/2磷酸化反應，第7d增加到最高水平，后出現輕度下降，基本與GFAP熒光強度平行增長(見圖1)，與實驗對照組有顯著差異(P＜0.05)。LPA+U0126注射后各個時間點均未見明顯的p-ERK1/2表達，但GFAP仍出現輕度的表達增加(見表1)，提示U0126能完全阻斷LPA誘導的ERK1/2磷酸化，但只部分抑制AST增殖(見圖1)。

2.3 LPA誘導的p-ERK表達在腦組織中的定位 在雙標檢測中，早期在GFAP陽性細胞中LPA誘導的p-ERK1/2未見明顯的表達，而在注射部位的神經元分布區有顯著的表達(見圖2A～C)。繼續觀察發現，注射后第14天在GFAP陽性細胞中有p-ERK1/2強烈的表達，且幾乎全部在該細胞中表達(見圖2D)，提示LPA誘導的ERK1/2磷酸化早期主要在神經元和其他細胞中表達，后期主要在AST中表達。

圖1 L組GFAP和p-ERK1/2熒光強度時程變化

3 討論

LPA是上世紀60年代發現并開始研究的一種細胞膜脂類衍生物，為中樞神經系統損傷部位出現最早的信號分子之一，它作為一種脂質生長因子因其具有強烈的促增殖效應而引起人們的廣泛關注。LPA具有促血小板聚集、平滑肌收縮、細胞增殖、增加緊密連接的通透性、促進細胞凋亡、壞死等多種生物學效應，在中樞系統損傷性疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。

星形膠質細胞增生(Astrocyte proliferation)是許多中樞神經系統疾病發生發展過程中常見的病理改變。近年來研究發現星形膠質細胞增生進而形成膠質瘢痕在中樞神經系統損傷、變性性疾病以及癲癇中起著重要的作用［4］。而國內外大量研究證實LPA的一個重要功能就是其能誘導多片腦區AST細胞增殖［5，6］，但關于 LPA 引起 AST 增殖的研究目前大多局限于細胞學水平，對于LPA誘導AST增殖的在體研究較少。Sorensen等［7］人的在體研究顯示，LPA能誘導大鼠紋狀體AST增殖。GFAP是特異性存在于AST中的中間絲，可用于標記損傷后膠質反應，其陽性表達提示星形膠質細胞的存在。本研究通過50μm LPA定位注射后發現大鼠海馬區GFAP陽性細胞數目明顯增多，隨時間延長，GFAP陽性表達細胞數逐漸增加，至少持續2w仍在快速增加。此結果提示LPA可以誘導大鼠海馬區AST增殖，這與細胞學研究結論相符，并首次在在體研究中證實之。但LPA作用途徑十分復雜，其促AST增殖機制尚不完全明了。

我們認為在急性缺血性心腦血管病、腦出血、腦挫傷等疾病發生時出現血漿LPA大量增加，導致神經元多種損傷，同時誘導AST大量增殖，形成膠質瘢痕阻礙神經元損傷后的修復以及其軸突再生，進一步加重了神經元細胞的損害。因此尋找一種有效的手段及時遏止AST的大量增殖可以有效地保護神經元，減輕其不可逆損傷，在中樞神經系統損傷性疾病的臨床治療上有著重要意義。目前研究已知LPA主要通過質膜上的G蛋白偶聯受體LPA1、LPA2、LPA3和LPA4發揮生物學功能，與LPA受體耦聯的主要有3種 G蛋白，即 Gi/o、Gq/11和 G12/13。Yart等人［8］的研究表明LPA可以通過與 LPA1耦聯的Gi蛋白活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑實現細胞增殖，另有文獻報道LPA通過與LPA3耦聯的Gq蛋白調節細胞內［Ca2+］濃度，最終激活 MAPK途徑實現細胞增殖［9］。而ERK1/2作為 MAPK家族的重要成員之一，廣泛存在于整個中樞神經系統中，在介導細胞反應的信號系統中起著重要作用。ERK1/2激活后可磷酸化核轉錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，參與多種細胞的增殖、分化以及凋亡等細胞行為［10］。U0126為蛋白激酶阻滯劑，可以特異性阻斷ERK1/2信號途徑，抑制MAPKS級聯反應，參與細胞周期調控［11］。LPA對AST的增殖效應能被U0126阻斷，證明LPA可以通過p-ERK1/2誘導AST的增殖。

但在我們的實驗中觀察到LPA對AST的增殖效應沒有被U0126完全阻斷，注射U0126與LPA混合液的部位GFAP陽性細胞數目仍有少量增加。同時在雙標檢測中我們還發現早期(＜7d)主要在神經元分布區域而非AST分布區域大量表達，繼續觀察發現p-ERK后期(14d)幾乎完全在AST表達。近年來有些學者認為神經元和星形膠質細胞之間通過緊密連接等連接方式存在著廣泛的聯系從而構成細胞之間信息交流的基礎［12］，因我們推測，本實驗中觀察到的LPA誘導的ERK1/2磷酸化細胞分布的變化可能是AST的激活繼發于其他細胞的激活的結果，也許是在體條件下LPA誘導AST增殖的另一途徑，因而解釋了U0126只能部分阻斷AST的增殖這一現象。

我們的研究結果顯示LPA可通過磷酸化ERK1/2誘導AST增殖，這為臨床上尋找抑制急性缺血性腦血管病、腦損傷引發LPA的釋放導致膠質細胞過度增生的治療提供了可能的藥物作用靶點。ERK抑制劑U0126的應用提示在LPA誘導大鼠海馬AST增殖中，除了有MAPK/ERK1/2信號轉導通路的參與外，還可能存在其他信號轉導通路的參與，這還有待進一步的研究證實。

圖2 GFAP和p-ERK1/2雙標圖(免疫熒光雙標記法)

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