延遲注射Z-VAD對大鼠局灶性腦缺血神經細胞凋亡及炎癥的影響

吳曉冬， 王麗娜， 薄立華， 劉 勇， 朱 輝

腦血管病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，其死亡人數也呈逐年上升的趨勢。缺血性腦梗死的病理過程涉及復雜的時間和空間級聯反應，雖然對其機制的了解越來越深入，但有效的治療手段仍然缺乏，仍然迫切需要研究新的治療方法。

十幾年研究表明，腦缺血時，除神經元壞死外，還有另外一種細胞死亡的形式-細胞凋亡，在腦缺血損傷的病理過程中起重要作用。近年來減少腦缺血再灌注損傷后神經元的凋亡一直是治療腦缺血的熱門課題。Caspase是一類半胱氨酸特異性的蛋白酶［1］，其對神經元的凋亡發生起關鍵作用。而ZVAD-fmk是非競爭性的 caspase抑制劑［2］，為此，我們用延遲注射Z-VAD-fmk治療大鼠局灶性腦缺血，通過TUNEL染色和ED-1表達檢測探討其對腦缺血的凋亡和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠，體重280 ～320g 共60 只，參照 Koizumi［3］和 Longa［4］發明的腔內線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦梗死動物模型(MCAo)，1h后拔出尼龍線，使之再通。隨機分為Z-VAD-fmk治療組、生理鹽水對照組，每組動物30只。

1.2 主要試劑 Z-VAD(MBL);ED-1單克隆抗體(Serotec);TUNEL試劑盒(Promega)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 在MCAo大鼠腦血流再通半個小時后固定于立體定位儀上，以1μl/min速度側腦室內泵入 Z-VAD-fmk 70μg/kg(4μl)，緩慢將針退出。對照組用相同體積的生理鹽水，注射一次。

1.3.2 分別在MCAo術后第1天、第4天、第7天各處死20只大鼠。用水合氯醛腹腔注射，呼吸降至1～2次/分時暴露心臟，用套管針穿刺左心室，拔出針芯后，將管頭置于升主動脈開口處，剪開右心耳，注入冰PBS，待肝臟變白后，灌注4%福爾馬林PBS固定液。-20℃放置1h后用咬骨鉗咬開顱骨，取出腦標本。選擇視交叉水平的腦組織切片，進行HE染色及TUNEL和ED-1免疫組化染色。

1.3.3 腦組織凋亡細胞的原位檢測(TUNEL法) 按試劑盒說明書進行，鏡下(×400)計數病變側大腦皮質5個視野中染色陽性細胞數目，取其均值。

1.3.4 ED-1免疫組化染色 按試劑盒說明，第一抗體4℃過夜，生物素標記的第二抗體，室溫孵育30min。新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min，用PBS沖洗，使反應停止。

1.3.5 陽性細胞計數 每組選10例標本，經統計學計算，實驗組與對照組的梗死程度沒有統計學意義。每例標本在梗死區域的中軸線上，均勻的選取5個高倍視野，計數陽性細胞數，5個區域陽性細胞數的平均值做為一個標本的數據。最后進行統計學計算量化結果。

2 結果

2.1 ED-1免疫組化染色結果 ED-1蛋白是細胞漿中的一種非分泌性蛋白，是巨噬細胞和活化的小膠質細胞的特異性標志，結果顯示在MCAo后第4天和第7天對照組與用藥組之間差異非常顯著(見表 1、圖1)。

2.2 TUNEL染色結果 TUNEL染色陽性細胞在MCAo術后第1天即有實驗組和對照組間的陽性細胞數的顯著差異，第4天和第7天也同樣有統計學差異(P ＜0.05)(見表2、圖2)。

表1 ED-1陽性細胞計數結果

表2 TUNEL陽性細胞計數結果

3 討論

腦缺血后再灌注損傷的發病機制較復雜，與自由基的生成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙、炎癥反應、凋亡等一系列因素有關［5］。急性局灶性腦缺血引起的缺血中心區死亡以細胞壞死為主，目前認識的比較清楚，而腦缺血半暗帶圍繞在壞死區周圍，是潛在的可挽救的結構完整腦區［5］。近年來認識到半暗帶區域于再灌注數天后出現了遲發性神經元死亡，主要發生在海馬、紋狀體及皮質區域。而細胞凋亡是神經元遲發性死亡的主要形式，因此，神經細胞凋亡是神經細胞喪失及神經功能損害的重要原因之一。

為此，人們力求尋找能抑制半暗帶細胞凋亡的方法來治療腦缺血，以抑制或減少遲發性神經元凋亡的發生，挽救半暗帶內神經元。已經明確凋亡存在著3條細胞信號傳導途徑，分別是死亡受體途徑、線粒體途徑及內質網途徑。最經典的是細胞內外各種死亡信號可誘導線粒體釋放Cyto-c，Cyto-c再與Apaf-1結合，使 Apaf-1發生構象改變。再與 procaspase-9結合，形成 Cyto-c Apaf-1 procaspase-9即“凋亡小體”(apoptosome)，從而使procaspase-9活化并激活下游其他 caspase［6～8］。但無論哪一條途徑都有 caspase的密切參與，完成凋亡過程。而 ZVAD-fmk(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)是一種非選擇性的不可逆性的細胞通透性肽類caspases抑制劑，通過與caspases氟甲烷酮(FMK)基團發生不可逆結合而發揮作用。ZVAD-fmk作用廣泛，是廣譜caspases抑制劑。應用Z-VAD-fmk可阻斷細胞凋亡，提高細胞存活率。2000年Huang等［9］首次發現，在缺血發作后應用ZVAD-fmk可以有效縮小缺血/再灌注損傷所造成的大鼠心肌梗死范圍。我們選擇延遲注射caspase抑制劑Z-VAD-fmk治療大鼠局灶性腦缺血，使之更符合臨床，觀察其對凋亡和炎癥的影響。

首先對病理標本進行了TUNEL染色，結果顯示在MCAo術后第1天即開始有凋亡陽性細胞的減少，而且在用藥組和對照組之間有顯著差異，說明在腦缺血的急性期，Z-VAD-fmk已開始發揮作用，而且貫穿腦缺血從第1天到第7天都有效果，皆顯示用藥組和對照組的明顯差異。

炎性反應是腦梗死的一個重要病理變化過程，它在腦梗死中的作用逐漸被學者所重視，那么，Z-VAD-fmk抑制了caspase，即抑制了凋亡的發生外，對炎癥是否有影響呢?因為與腦缺血炎癥反應關系密切的炎癥細胞主要有白細胞與單核-巨噬細胞［10］。在腦梗死的早期(1d以內)中性粒細胞就開始浸潤，持續3d左右，即消失;從梗死后3d開始，巨噬細胞大量出現在損傷區域，一直持續到梗死后3w或更長。它的作用開始被認為主要是清理損傷區域，幫助損傷區域盡快恢復，近年來，隨著研究的不斷深入，發現過高水平的炎性反應會加重腦損傷，擴大損傷面積，只有適度的炎性反應對于腦損傷才是有益的，通常腦梗死的炎性反應水平都是過高的，是對腦組織不利的。許多學者證實在腦梗死后降低炎性反應水平，抑制巨噬細胞浸潤，可減少梗死面積。為此，我們采用ED-1抗體對標本進行了免疫組織化學染色。ED-1是細胞漿中的一種非分泌性蛋白，是巨噬細胞和活化的小膠質細胞的特異性標志，結果顯示在MCAo后第4天和第7天對照組與用藥組之間差異非常顯著。本實驗結果提示在腦室內延遲注射caspase抑制劑Z-VAD-fmk后，ED-1陽性細胞數明顯少于對照組，這說明Z-VAD-fmk可以抑制炎性反應。

由此說明，延遲注射Z-VAD-fmk可對腦缺血有神經保護作用，它的作用途徑是多方面的，其中抑制炎性反應和細胞凋亡是兩個重要方式。

圖1 ED-1染色(DAB顯色×400)(箭頭所示陽性細胞);(A):Z-VAD-fmk治療1d(B):Z-VAD-fmk治療4d;(C):Z-VAD-fmk治療7d;(D):對照1d;(E):對照4d;(F):對照7d

圖2 TUNEL染色(DAB顯色×400)(箭頭所示陽性細胞);(A):Z-VAD-fmk治療1d(B):Z-VAD-fmk治療4d;(C):Z-VAD-fmk治療7d;(D):對照1d;(E):對照4d;(F):對照7d

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