重癥肌無(wú)力患者免疫治療過(guò)程中sIL-6R的動(dòng)態(tài)演變

劉汝宏， 叢志強(qiáng)， 鐘孟飛， 王海萍， 李 江， 陳曉輝

重癥肌無(wú)力(MG)是T細(xì)胞依賴(lài)性的抗神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)突觸后膜上乙酰膽堿受體抗體(ACh-Rab)介導(dǎo)的自身免疫性疾病［1，2］，而對(duì) T 細(xì)胞的依賴(lài)性主要是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(CK)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，許多證據(jù)表明，CK在MG發(fā)病和病情演變中起重要作用［2，3］。白細(xì)胞介素-6(IL-6)刺激靜止的T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞終末分化，促進(jìn)AChRab的產(chǎn)生，主要參與體液免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié);可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL-6R)具有膜白細(xì)胞介素6受體(mIL-6R)的功能，不僅介導(dǎo)且能增強(qiáng)IL-6的生物學(xué)作用［4］。

本研究主要從體液免疫方面(sIL-6R、AChRab)對(duì)MG進(jìn)行研究，在免疫治療過(guò)程中，對(duì)兩者進(jìn)行動(dòng)態(tài)同步檢測(cè)，旨在揭示MG患者血清中兩者含量的變化規(guī)律，探討兩者與MG發(fā)病及病情演變的相互關(guān)系、兩者反映MG免疫治療的效應(yīng)狀況、以及可能的治療價(jià)值，從而為進(jìn)一步闡明MG的免疫發(fā)病機(jī)制及為MG的免疫治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 病例組(MG組) 所有研究對(duì)象系1999年3月～2010年12月間北京航天總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及山東省勝利油田中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診就診和住院的患者。根據(jù)典型臨床表現(xiàn)、疲勞試驗(yàn)和新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性確診。76例均為初診患者或已停用免疫抑制劑6個(gè)月以上的復(fù)發(fā)者。其中男性37例、女性39例，年齡6 ～67(37.8 ±13.2)歲，病程最短15d，最長(zhǎng)10年，平均1.9±0.34年。按改良的Osserman分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ型20例、Ⅱa型19例、Ⅱb型13例、Ⅲ型11例、Ⅳ型13例。MG患者肌無(wú)力嚴(yán)重程度采用許氏絕對(duì)評(píng)分法［5］量化，并按首次取標(biāo)本時(shí)的絕對(duì)評(píng)分分成輕(≤15分)、中(16～30分)、重(31～45分)、極重度(46～60分)4組。按縱隔CT檢查結(jié)果分為胸腺正常組25例、胸腺增生組39例、胸腺瘤組12例。按所用免疫抑制劑不同分為單用類(lèi)固醇組、及類(lèi)固醇并用環(huán)磷酰胺組，類(lèi)固醇的應(yīng)用按我院神經(jīng)內(nèi)科常用的漸減法或漸增法，用2～3w后，若無(wú)效或加重，并用CTX(15mg/kg/次/w)，免疫抑制劑治療6w后留取標(biāo)本，并同時(shí)對(duì)病情進(jìn)行評(píng)分。

1.1.2 正常對(duì)照組(NC組) 系同期健康查體者，共48例，其中男性22例、女性26例，年齡12～69(34.2±16.1)歲。與病例組年齡、性別構(gòu)成基本一致，兩組年齡之間經(jīng)t檢驗(yàn)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。所有研究對(duì)象均無(wú)自身免疫性疾病(除MG外)史，無(wú)腫瘤病史及腎臟病史，近期內(nèi)無(wú)感染病史，6個(gè)月內(nèi)未使用腎上腺皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。無(wú)高血壓、糖尿病、潰瘍病等類(lèi)固醇激素的禁忌證。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 所有研究對(duì)象均在早晨7時(shí)～8時(shí)，采肘靜脈血6ml，經(jīng)離心分離血清，分裝在3個(gè)凍存管內(nèi)，-70℃保存待測(cè)。

1.2.2 血清sIL-6R含量的測(cè)定 sIL-6R試劑盆由深圳晶美生物用品公司提供美國(guó)Genzyme公司產(chǎn)品。原理:應(yīng)用ELISA雙抗體夾心法。抗人sIL-6R單抗包被于酶標(biāo)板條上，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本中的sIL-6R，加入生物素化的抗人sIL-6R，加入酶聯(lián)物顯色，應(yīng)用Σ960型酶標(biāo)儀測(cè)其光密度值及sIL-6R濃度。

1.2.3 MG患者血清AChRab測(cè)定 試劑盒由上海太陽(yáng)生物制品公司提供。采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 MG組、NC組血清sIL-6R水平的比較MG患者血清 sIL-6R 水平(48.5±12.6ng/ml)明顯高于健康對(duì)照組(38.2±11.3ng/ml)，兩者之間的差別具有高度顯著性意義(P＜0.01)。

2.2 MG患者不同臨床類(lèi)型血清sIL-6R水平MG患者不同性別間、不同年齡階段間、以及在血清抗體陽(yáng)性(SPMG)和抗體陰性(SNMG)組間血清sIL-6R水平的差別無(wú)顯著性意義(P＞0.05);病程＞1年組患者血清sIL-6R水平明顯高于病程＜6個(gè)月組(P＜0.05);Osserman分型Ⅲ型及Ⅳ型組患者血清sIL-6R水平均高于Ⅰ型組(P＜0.05);胸腺增生組患者血清sIL-6R水平明顯高于胸腺正常組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 MG患者不同臨床組別清血sIL-6R(ng/ml)水平

2.3 MG患者免疫抑制治療前后血清sIL-6R水平變化 在免疫抑制劑治療前，極重組患者血清sIL-6R水平明顯高于輕度組，兩組間差別具有高度顯著性意義(P＜0.01)，重度組患者血清sIL-6R水平明顯高于輕度組患者(P＜0.05);免疫抑制治療6w后，輕、中度組患者評(píng)分明顯低于治療前評(píng)分，兩者的差別具有高度顯著性意義(P＜0.01及P＜0.02)，上述兩組患者血清sIL-6R水平在免疫抑制治療后明顯低于治療前(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

2.4 MG患者不同免疫抑制劑治療組血清sIL-6R水平 單用皮質(zhì)類(lèi)固醇組(單用組)患者治療6w后病情絕對(duì)評(píng)分低于治療前評(píng)分(P＜0.05)，該組患者血清sIL-6R水平在治療6w后明顯低于治療前水平(P＜0.05);皮質(zhì)類(lèi)固醇+環(huán)磷酰胺(治療時(shí)間為3～4w)組(并用組)在治療前后評(píng)分及sIL-6R水平的差別無(wú)顯著性意義(P＞0.05)(見(jiàn)表3)。

2.5 不同病程MG患者免疫抑制治療前后血清sIL-6R水平 病程＜6月組患者血清sIL-6R水平在免疫抑制治療6w后明顯低于免疫治療前，兩者間差別具有顯著性意義(P＜0.05)，余各病程組在免疫治療前后各項(xiàng)水平的差別無(wú)顯著性意義(P＞0.05)(見(jiàn)表 4)。

2.6 MG患者病情與血清sIL-6R的關(guān)系 許氏絕對(duì)評(píng)分法是對(duì)MG患者肌無(wú)力嚴(yán)重程度的量化評(píng)定。對(duì)MG患者血清sIL-6R水平與絕對(duì)評(píng)分所得絕對(duì)計(jì)分值進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線回歸檢驗(yàn)，血清sIL-6R水平與MG患者病情明顯相關(guān)(R2=0.513)。

表2 MG患者免疫治療前后血清sIL-6R(ng/ml)水平

表3 MG患者不同免疫抑制劑治療組血清sIL-6R(ng/ml)水平

表4 不同病程MG患者免疫抑制治療前后血清sIL-6R(ng/ml)水平

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞依賴(lài)機(jī)制在MG發(fā)病、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，尤其是輔助性T細(xì)胞(Th)在調(diào)節(jié)AChRab的產(chǎn)生過(guò)程中作用更為突出［6～8］，活化的 Th可以釋放多種 CK，Th1主要分泌 IL-2、IFNγ、TNF;Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNFα，這些CK通過(guò)旁分泌或自分泌途徑，通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)一步使T、B細(xì)胞活化/分化、增殖，產(chǎn)生大量自身抗體(主要是AChRab)而致肌無(wú)力的產(chǎn)生［1，9］。sIL-6R 是由于蛋白酶的作用使 IL-6R 胞外區(qū)從細(xì)胞上脫落下來(lái)形成的，或在mRNA水平上缺失編碼跨膜區(qū)的堿基對(duì)而只形成胞外區(qū)域形成的。sIL-6R缺失了IL-6R細(xì)胞內(nèi)域和跨膜區(qū)，其結(jié)合并增強(qiáng)配基IL-6的作用與其它可溶性細(xì)胞因子受體(sCKR)不同，它非但不是mIL-6R的拮抗劑，反而是mIL-6R的激動(dòng)劑，主要參與機(jī)體的體液免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)過(guò)程［4，7］。

Cohen-Kaminsky等［10］發(fā)現(xiàn)，MG 患者胸腺上皮細(xì)胞異常表達(dá)IL-6，其IL-6mRNA表達(dá)量及IL-6含量均顯著增高，外源性信號(hào)如脂多糖(LPS)、IL-1、TNFα刺激能加強(qiáng)其表達(dá)。Matusevicius等［11］將MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)與AChR短期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MNC IL-6mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高。Bongioanni等［12］證實(shí)MG患者外周血Th細(xì)胞IL-6R數(shù)量較對(duì)照組顯著增多，與IL-6結(jié)合的能力也增強(qiáng)，并認(rèn)為T(mén)h細(xì)胞結(jié)合能力增強(qiáng)是由于Th細(xì)胞具有更多的IL-6R。這些均說(shuō)明IL-6及IL-6R在MG發(fā)病中起促進(jìn)作用。

sIL-6R主要參與機(jī)體體液免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，有人研究自身免疫性疾病的典型動(dòng)物模型MRL/Lpr小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠的成長(zhǎng)，血清中sIL-6R和IL-6水平顯著升高，二者呈正相關(guān)［11］。本研究顯示MG患者血清sIL-6R水平明顯高于健康對(duì)照組(P ＜0.01)，結(jié)合 Rapoport［13］等的研究，IL-6 系統(tǒng)參與了MG的發(fā)病，即IL-6刺激B細(xì)胞產(chǎn)生AChRab是MG發(fā)病環(huán)節(jié)之一，IL-6水平升高，機(jī)體“試圖”通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6R起到自我免疫保護(hù)作用，結(jié)果導(dǎo)致sIL-6R水平上升，由于sIL-6R的特殊性，sIL-6R不僅不能阻礙IL-6的免疫損傷，反而增強(qiáng)其作用，因此，在無(wú)其它因素影響下，IL-6/IL-6R/sIL-6R自分泌環(huán)是一惡性循環(huán)［14］，sIL-6R水平升高本是機(jī)體免疫保護(hù)調(diào)節(jié)的結(jié)果，但卻可能反映著免疫損傷的程度。從不同臨床組別的比較研究中發(fā)現(xiàn)，病程1年以上的MG患者血清sIL-6R水平明顯高于病程6個(gè)月以下者(P＜0.05)，后者經(jīng)免疫抑制劑治療6w后，血清sIL-6R水平明顯下降，反應(yīng)病程長(zhǎng)者(＞1年)，sIL-6R水平高，免疫損傷程度重，免疫治療效應(yīng)比病程短者(＜6月)差;在Osserman分型中可見(jiàn)，病程相對(duì)長(zhǎng)的、病情相對(duì)重的Ⅲ、Ⅳ型患者血清sIL-6R水平更高，提示血清sIL-6R水平與MG病情可能相關(guān);在本研究中，胸腺增生組血清IL-6R水平明顯高于胸腺正常組(P＜0.05)，胸腺瘤組MG患者血清sIL-6R水平與胸腺正常組差別不明顯(P＞0.05)，提示兩者發(fā)病過(guò)程可能不同，胸腺增生的MG患者可能較胸腺瘤者的Th2細(xì)胞免疫功能紊亂明顯［15］，而IL-6主要由Th2細(xì)胞分泌，因此出現(xiàn)胸腺增生組患者sIL-6R水平更高的現(xiàn)象。經(jīng)原位雜交和免疫組化研究發(fā)現(xiàn)［16］，胸腺內(nèi)增生小葉周?chē)懈叨缺磉_(dá)的IL-6mRNA，在胸腺瘤患者中卻未見(jiàn)到類(lèi)似改變。

為了更明確MG患者病情與血清sIL-6R水平的關(guān)系，用MG患者病情許氏評(píng)分法計(jì)分結(jié)果與sIL-6R水平進(jìn)行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，絕對(duì)評(píng)分≥31患者血清sIL-6R水平高于輕度組患者(P＜0.01或 P＜0.05)，且評(píng)分越高者-極重組與輕度組患者差別更明顯(P＜0.01)，說(shuō)明MG患者病情與血清 sIL-6R水平可能存在相關(guān)性，對(duì)兩者進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線回歸檢驗(yàn)證實(shí)，兩者明顯相關(guān)，即MG患者病情越重，血清sIL-6R水平越高。研究同時(shí)提示病情較輕的患者(評(píng)分≤30)經(jīng)免疫治療后病情改善明顯(P＜0.05)，而且，這些患者血清sIL-6R水平在治療后也明顯降低(P＜0.05)，這一方面對(duì)上述觀點(diǎn)再次進(jìn)行了證實(shí)，即同一患者在治療過(guò)程中隨著病情演變血清sIL-6R水平也相應(yīng)變化，即病情與sIL-6R水平明顯相關(guān);同時(shí)為MG患者病情演變(療效)的觀察提供了一個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo);也提示MG患者體液免疫紊亂程度(或病情)與免疫治療效應(yīng)間可能存在相關(guān)性［13］。

sIL-6R的研究在MG臨床治療上具有潛在意義，通過(guò)構(gòu)建sIL-6R的突變體，尋找到一種能與IL-6結(jié)合，但不能與gP130結(jié)合的分子，作為IL-6的拮抗物與 IL-6R 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 IL-6［11，14］，應(yīng)用于 IL-6 相關(guān)疾病(如MG)的治療。

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