吸氧預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡及CHOP/GADD153表達研究

巴曉紅， 潘鳳英

研究發現，大鼠持續吸入純氧氣24h可以誘導明顯的腦缺血耐受稱為OIP［1］，目前在動物模型上研究證明腦缺血再灌注后有大量神經細胞凋亡，凋亡是腦缺血再灌注損傷后神經死亡的重要方式［2］。目前已知的凋亡途徑有:死亡受體(death receptor 5，DR)介導的凋亡通路、線粒體/細胞色素c介導的凋亡通路、內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑。ERS是引起凋亡的重要機制之一，目前機制仍未完全闡明。目前OIP對腦缺血再灌注損傷的保護作用在凋亡調控基因Bcl-2、Bax、原癌基因cfos、星形膠質細胞的激活、SOD的活性增強等方面已有報道，但OIP是否對大鼠局灶腦缺血再灌注模型ERS及其誘導的細胞凋亡影響的研究未見報道。CHOP/GADD153是ERS的兩個經典標志物之一［3］。本實驗通過觀察OIP對大鼠腦缺血再灌注損傷后ERS途徑導致的細胞凋亡及經典標志物CHOP/GADD153的表達，全面動態闡明OIP對局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)動物:狼褰嗉禨D大鼠180只，雌雄各半，體重250～300g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。飼養條件25℃，相對濕度為60%，光照時間12h/d，清潔飲水，標準飼養。(2)儀器和試劑:麻醉氣體分析儀，兔抗大鼠GADDl53免疫組化試劑盒(北京博奧森生物工程公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(美國promega公司)，CIAS-1000型細胞圖像分析儀，ECL試劑(上海普飛公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將健康SD大鼠隨機分為模型組、假手術組和OIP組。每組按再灌注時間點(從線栓拔出時算起)不同再分為3h組、12h組、24h組、48h組、72h組，每組隨機選12只大鼠，到相應時間點立即處死。模型組和OIP組大鼠均用線栓法造成右側MCAO模型，2h后開放灌注。OIP組大鼠于術前置于OIP密閉吸氧箱內，內置鈉石灰吸收二氧化碳，輸入100%醫用氧氣，用麻醉氣體分析儀監測氧氣濃度達100%開始計時，持續吸氧24h，間隔24h后造模(方法同模型組)。

1.2.2 動物模型的制備 線栓法［4］制作大腦右側 MCAO 模型［5，6］，缺血2h 后將栓線拔出使其血流恢復，假手術組將栓線插入后隨即拔出。

1.2.3 腦片制作及組織保存 OIP組將動物持續吸100%氧24 h，間隔24 h后行大腦中動脈缺血再灌注模型，造模成功并于再灌注后3h、12h、24h、48h、72h時間點每組隨機取6只大鼠用4%多聚甲醛局部灌注內固定，斷頭取腦，自額區至枕區分為A、B、C、D、E五等分，取C腦片常規酒精脫水，石蠟包埋制成5μm厚防脫切片，分別行tunel檢測、GADD153免疫組化染色。另外，每組隨機取6只大鼠于相應時間點麻醉后立即處死，在冰臺上迅速分離出海馬組織立刻置于液氮中保存，以備行Western-Blot檢測。

1.2.4 神經功能評分 參照文獻［7］對大鼠進行神經功能評分，0分:無明顯神經功能缺損表現;1分:不能伸展左側前肢;2分:行走時向左側旋轉;3分:行走時向左側傾斜;4分:行走時向左側傾倒，意識喪失。

1.2.5 Tunel染色 采用TUNEL法原位標記DNA片斷，檢測凋亡細胞，試劑盒由美國promega公司提供，嚴格按照說明書進行操作。每例大鼠隨機選取6張相同部位切片，在缺血再灌注側海馬CA1區隨機選取6個不重疊高倍鏡視野(×200)，計算陽性細胞 (胞核含棕黃色顆粒)率［(陽性細胞數/計數細胞總數)×100%］。

1.2.6 免疫組化染色 GADD153免疫組化染色試劑盒購于北京博奧森生物工程公司，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)免疫組化染色檢測GADD153，切片常規脫蠟水化后放入新鮮配制的3%H2O2溶液中室溫下孵育10min，微波抗原修復后，滴加羊血清封閉液15min，滴加兔抗GADD153抗體室溫孵育15min，于4℃過夜，滴加生物素化羊抗鼠IgG 15min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫下孵育15min，以上各步驟除了滴加羊血清封閉液一步外均用PBS洗3min×3次，最后用DAB顯色。每例大鼠隨機選取6張相同部位切片，在缺血再灌注側海馬CA1區隨機選取6個不重疊高倍鏡視野(×200)，計數陽性細胞數(胞核含棕黃色顆粒)。

1.2.5 Western-Blot檢測 采用胞核-胞漿蛋白裂解液裂解蛋白，BCA法蛋白定量(PIERCE公司)。上樣后SDS-PAGE凝膠電泳;濕轉法轉PVDF膜;一抗(1∶200)4℃孵育過夜后二抗孵育;ECL試劑(上海普飛公司)發光顯影成像;光片于凝膠成像系統白光下掃描，進行吸光度分析，用同一標本內參進行校正，并按公式相對值=目的條帶表達強度/tubulin表達強度計算出相對值。

1.2.6 統計學方法 采用spss13.6軟件統計分析，檢測數據用表示，多組間比較采用析因設計的方差分析法，組間和組內差異性比較在方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OIP對大鼠局灶腦缺血再灌注后的神經功能評分比

大鼠麻醉清醒后神經功能缺損癥狀和體征:假手術組大鼠自由活動、進食，無明顯的癥狀和體征;模型組大鼠活動和進食均減少、出現右側Horner征、精神萎靡，左上肢癱瘓，肌力減退，行走時向左側偏斜或旋轉，有的跌倒或完全癱瘓，大鼠神經行為學評分:假手術組各時間點大鼠分別為3.00±0.48、3.01 ±0.44、2.99 ±0.50、3.01 ±0.42、3.02 ±0.41，差異無顯著性(P＞0.05)。模型組與假手術組比較，差異顯著(P＜0.05)，評分明顯增加，24h時間點與組內其它時間點比較，差異顯著(P＜0.05)，評分顯著增加。OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，評分明顯減少(見表1)。

2.2 Tunel法檢測細胞凋亡結果

假手術組各時間點偶見凋亡細胞，組內各時間點比較，差異無顯著性(P＞0.05)。模型組與假手術組比較，差異顯著(P＜0.05)，再灌注3h偶見少量凋亡細胞(4.17% ±1.11%)，12h后凋亡細胞開始明顯增多(24.54% ±3.10%);至 24h，凋亡細胞數量達高峰(51.90% ±8.29%)，細胞核濃縮，呈棕色或棕褐色，核形不規則，致密，形狀不規則;再灌注48h凋亡細胞減少(36.93% ±5.63%)，至72h凋亡細胞明顯減少(15.04% ±2.29%)。24h時凋亡率最高，與組內其它時間點比較，差異顯著(P＜0.05)。OIP組凋亡率與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，各時間點較模型組均減少(見圖1、表2)。

2.3 GADD153免疫組化結果

假手術組大鼠各時間點GADD153極少見陽性表達，陽性細胞平均灰度值為 144.67±7.30、145.00 ± 18.49、143.82 ± 13.54、146.96 ± 6.35、143.78±10.58，各時間點比較，差異無顯著性(P ＞0.05)。模型組與假手術組比較，差異顯著(P＜0.05)，缺血再灌注3h，可見少量陽性細胞，陽性表達主要位于細胞核，核呈棕黃色，胞漿可有黃染，平均灰度值為126.60±5.65，再灌注12h陽性細胞開始增多，平均灰度值為111.41 ±14.44，至 24h，陽性細胞數量達高峰，平均灰度值為97.75±16.12，48h陽性細胞開始減少(112.40±10.25)，至再灌注72h陽性細胞明顯減少(124.94±9.66)，再灌注24h與組內其它時間點比較，差異顯著(P＜0.05)，陽性細胞數量最多。OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，OIP組陽性表達明顯減少(見圖2、表3)。

2.4 Western-blot檢測結果

Western-blot檢測示 GADD153目的條帶為29Kda。各組3h時間點和假手術組 GADD153均未見明顯蛋白條帶，模型組于再灌注12h后可見少量表達，至再灌注24h達高峰，48h之后逐漸下降，72h僅有少量表達。12h，24h，48h，72h時間點 OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，表達大幅度減少(見圖3、表4)。

表1 OIP對局灶腦缺血再灌注大鼠神經行為學評分的影響(，n=6)

表1 OIP對局灶腦缺血再灌注大鼠神經行為學評分的影響(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術組比較▽P＜0.05;與組間不同時間點比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術組模型組OIP組3.00 ±0.48 4.66 ±0.26▽3.50 ±0.30△3.01 ±0.44 5.01 ±0.29▽4.02 ±0.29△2.99 ±0.50 5.55 ±0.24▽※4.49 ±0.30△3.01 ±0.42 5.02 ±0.27▽4.09 ±0.27△3.02 ±0.41 4.78 ±0.26▽3.60 ±0.28△

表2 各組各時間點右側海馬CA1區細胞凋亡率(%)(，n=6)

表2 各組各時間點右側海馬CA1區細胞凋亡率(%)(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術組比較▽P＜0.05;與組間不同時間點比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術組模型組OIP組1.01 ±0.01 4.17 ±1.11▽1.05 ±0.02△0.90 ±0.09 24.54 ±3.10▽12.30 ±2.13△1.00 ±0.02 51.90 ±8.29▽※17.56 ±2.60△1.01 ±0.02 36.93 ±5.63▽10.28 ±2.47△1.01 ±0.01 15.04 ±2.29▽3.42 ±0.69△

表3 各組大鼠海馬右側CA1區GADD153表達平均灰度值(，n=6)

表3 各組大鼠海馬右側CA1區GADD153表達平均灰度值(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術組比較▽P＜0.05;與組間不同時間點比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手組模型組OIP組144.67 ±7.30 126.60 ±5.65▽136.28 ±16.44△145.00 ±18.49 111.41 ±14.44▽130.05 ±9.31△143.82 ±13.54 97.75 ±16.12▽※112.07 ±6.53△146.96 ±6.35 112.40 ±10.25▽125.73 ±11.93△143.78 ±10.58 124.94 ±9.6▽135.30 ±9.18△

表4 各組大鼠缺血側海馬CA1區GADD153表達相對值(，n=6)

表4 各組大鼠缺血側海馬CA1區GADD153表達相對值(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術組比較▽P＜0.05;與組間不同時間點比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術組模型組OIP組000 0 0.1776 ±0.04▽0.071 ±0.01△0 0.6081 ±0.05▽※0.2432 ±0.01△0 0.5179 ±0.03▽0.2072 ±0.01△0 0.3563 ±0.04▽0.1425 ±0.01△

圖1 Tunel法檢測細胞凋亡結果

圖2 GADD153免疫組化結果

圖3 GADD153(29KD)Western-blot條帶

3 討論

巴曉紅［8］、張西京［9］等實驗顯示，OIP 后腦缺血再灌注模型得以增強超氧化物岐化酶的活性，清除氧自由基，誘導凋亡相關基因 Bax、Bcl-2表達，但OIP對大鼠腦缺血再灌注模型過度ERS中未折疊蛋白反應及其誘導的細胞凋亡的影響尚未見報道。

腦缺血再灌注后存在鈣穩態失衡和過氧化損傷，由此可引起ERS，激活未折疊蛋白反應(unfoldprotein response，UPR)，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應應激，但是長時間過強的ERS則啟動細胞凋亡。本實驗中模型組GADDl53表達上調表明缺血再灌注啟動了ERS，激活UPR，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應應激，GADD153是ERS的經典標志物［10］，GADD153在正常情況下位于胞漿，表達水平極低;然而在應激情況下可移位至胞核，表達顯著增加。本實驗結果表明，在相應時間點模型組與假手術組比較，GADD153免疫組化結果陽性細胞平均灰度值和 Western-blot檢測結果GADD153蛋白含量相對值及細胞凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，GADD153在 24h時表達最高，凋亡在24h達到高峰，且GADD153上調與神經細胞凋亡保持一致。

現己知，哺乳動物的UPR信號轉導形成了3條相互聯系的通路:內質網轉膜蛋白激酶通路:(ER transmembrane protein kinase，IREI);雙鏈 RNA 激活蛋白激酶樣內質網激酶(double-stranded RNA-activatedprotein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)通路和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路。ERS時，UPR反應通過下調翻譯和上調內質網伴侶分子等減少ERS，達到保護細胞的目的;但持續或過強的UPR效應可誘導原本與IREI、PERK、ATF6緊密結合的 GRP78與之解離，進而激活GADD153和caspase-12等的活性，誘導細胞的凋亡。3條通路的之間的聯系:通路之間的功能重疊現象:雖然IRE1，PERK和ATF6的激活是各自獨立的，但是在UPR的過程中卻存在廣泛的交流。這3條信號通路都可以誘導GADD153轉錄，但是這其中 PERK 通路最重要［11，12］。GADD153 是一個由抗凋亡向促凋亡轉換的重要信號分子，可以抑制BCL-2并可以使線粒體對BH3-only蛋白敏感，使細胞谷胱甘肽耗竭引起細胞凋亡。過表達GADD153可以導致細胞周期停滯并最終使細胞凋亡，但對其下游認識還十分有限［13］。GADD153是一個b-ZIP轉錄因子，屬于CCAATP增強子連接蛋的轉錄因子C/EBP家族.正常情況下它表達非常低:在ERS時，通過以下機制上調表達:(1)內質網跨膜蛋白 IREI和 ATF6活化［14］。其胞漿活性部分(XBP1和ATF6)進入核內，與ERS反應元件序列中的CCAAT N9-CCACG中的CACG相連，在NF-Y的協同作用下，啟動GADD153轉錄與表達;(2)通過PERK-6172a途徑活化，導致轉錄因子ATF4和ATF3表達，前者結合氨基酸調控元件，再誘導GADD153表達。GADD153可能通過下調Bcl-2表達、耗竭谷胱甘肽、促進活性氧族產生等，活化caspase-3，最終導致細胞凋亡［15］。GADD153基因敲除可增強細胞對抗ERS所致凋亡的能力;與此相反，GADD153過度表達的細胞則對ERS所致凋亡更為敏感。

我們實驗結果表明，在腦缺血再灌注術前24 h，給予大鼠吸入100%純氧24h，各時間點可以發現模型組與假手術組比較，GADD153陽性細胞灰度值、蛋白含量相對值和凋亡細胞率均明顯增加(P＜0.05)，OIP組較模型組均減少(P ＜ 0.05)。GADD153陽性細胞灰度值、蛋白含量相對值和Tunel檢測凋亡細胞率結果在24h時表達最高，證實GADD153上調與神經細胞凋亡一致。OIP可以抑制GADD153上調，證實OIP對大鼠局灶腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能是:(1)直接對抗缺血神經元缺氧及自由基的產生，減輕ERS。(2)可降低PERK通路相關基因GADD153及GADD34在缺血半暗帶的表達，從而抑制缺血再灌注誘發的內質網應激，發揮減輕神經細胞凋亡的作用減輕了經由GADD153途徑誘導的凋亡。(3)通過抑制某些促凋亡基因(如 caspase-3、c-fos、c-Jun、p53)和/或促進某些抑凋亡基因(如Bcl-2、HSP70)等的表達，抑制GADD153的表達。

本實驗證實OIP對大鼠局灶腦缺血再灌注損傷有保護作用，從而為治療缺血性腦血管疾病提供一個重要的新思路。

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