利多卡因氯己定氣霧劑無(wú)菌檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)

胡文紅 王德利

利多卡因氯己定氣霧劑為復(fù)方制劑，其主要組分為利多卡因、醋酸氯已定和苯扎溴銨，用于一般割傷、擦傷軟組織損傷、灼傷、曬傷以及蚊蟲(chóng)叮咬、熱痱瘙癢等。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部規(guī)定，用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑需進(jìn)行無(wú)菌檢查。筆者按《中國(guó)藥典》2010年版二部規(guī)定無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)用的4株細(xì)菌、2株真菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉)對(duì)兩個(gè)生產(chǎn)廠家的樣品進(jìn)行了無(wú)菌檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法是否適合于該制劑的無(wú)菌檢查［1］。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSC-1500ⅡA2-X生物潔凈安全柜;MJ-250I生化培養(yǎng)箱;GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱;SartoriusCP225 d電子天平;HTY-2000B集菌儀(杭州泰林醫(yī)療器械廠生產(chǎn));PY220、PY330一次性全封閉集菌器(杭州泰林醫(yī)療器械廠生產(chǎn))。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (100409)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(090518)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(090922)、改良馬丁培養(yǎng)基(100108)、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(100323)均購(gòu)于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司

1.3 稀釋液(沖洗液) pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液購(gòu)于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司、含1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(自配)。

1.4 實(shí)驗(yàn)用樣品 利多卡因氯己定氣霧劑(規(guī)格：60 g/瓶)分別為山東京衛(wèi)制藥有限公司(批號(hào)：0904008)、濟(jì)南為民制藥有限公司(批號(hào)：091020)

1.5 菌株 大腸埃希菌(Eschrichia coli)［CMCC(B)44 102］、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64941］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］、白色念珠菌 (Candida albicans)［CMCC(F)98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］均購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，以上菌種均為第3代菌種。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備［1］按《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄“無(wú)菌檢查法”項(xiàng)下方法制成小于100 cfu/ml的菌懸液。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.2.1 樣品的取樣量 根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部無(wú)菌檢查法的有關(guān)規(guī)定［1］，驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)每一株驗(yàn)證菌株需要的樣品量相當(dāng)于每一濾筒的樣品量。按此樣品的規(guī)格：60 g/瓶，取樣量為5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，備用。

2.2.2 稀釋液的選擇試驗(yàn) 取本品5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，分別轉(zhuǎn)移至200 ml pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、含1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液中，振搖后，取PY220一次性全封閉集菌器(兩聯(lián))一套，按薄膜過(guò)濾法處理，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液分別沖洗濾膜3次，每次100 ml/膜，泵入相同培養(yǎng)基后，于兩筒中分別接入小于100 cfu/ml的試驗(yàn)菌。前者作為陽(yáng)性對(duì)照筒，后者作為試驗(yàn)筒。各試驗(yàn)菌同法操作。再取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基分別泵入另兩筒集菌器中，作為陰性對(duì)照筒。按規(guī)定溫度將述集菌器培養(yǎng)3～5 d。其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 稀釋液的選擇試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 表1結(jié)果表明，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液，在規(guī)定溫度培養(yǎng)后，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌均有抑制作用，各試驗(yàn)筒均未有菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照筒生長(zhǎng)良好;但對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無(wú)抑制作用，試驗(yàn)筒和陽(yáng)性對(duì)照筒均生長(zhǎng)良好;而用含1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液，在規(guī)定溫度培養(yǎng)后，對(duì)驗(yàn)證試驗(yàn)用的6種標(biāo)準(zhǔn)菌株均無(wú)抑制作用，各試驗(yàn)筒和陽(yáng)性對(duì)照筒均生長(zhǎng)良好。

2.2.4 沖洗液的選擇試驗(yàn) 取本品5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，轉(zhuǎn)移至200 ml pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖后，取PY220一次性全封閉集菌器(兩聯(lián))一套，按薄膜過(guò)濾法處理，分別用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、含1%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液分別沖洗濾膜3次，每次100 ml/膜。以下操作步驟同前。其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 沖洗液的選擇試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 表2結(jié)果和表1結(jié)果完全一致。從以上試驗(yàn)結(jié)果可知，把1%聚山梨酯80加在稀釋液或沖洗液中作為中和劑來(lái)消除藥品的抑菌作用效果是一樣的。兩個(gè)生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品同法操作，結(jié)果也完全一致。

2.2.6 中和劑的驗(yàn)證試驗(yàn)［2］證明一種中和劑是否適當(dāng)主要基于兩點(diǎn)，一是對(duì)微生物生長(zhǎng)的毒副作用，二是有效性。

毒副作用：方法同上。取1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 ml濾過(guò)集菌器，分別泵入100 ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，再分別接入小于100 cfu/ml的各試驗(yàn)菌。按規(guī)定溫度培養(yǎng)、觀察。結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果顯示，用于無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)用的6株試驗(yàn)菌株在此條件下均生長(zhǎng)良好。

表3 毒副作用試驗(yàn)結(jié)果

有效性：由表1、2中可見(jiàn)，在pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中添加1%聚山梨酯80，不筒當(dāng)稀釋液還是沖洗液，都能有效地降低藥品的抑菌性，使檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)化、便于操作，提高準(zhǔn)確性，符合驗(yàn)證試驗(yàn)要求，可以作為中和劑。

3 利多卡因氯己定氣霧劑無(wú)菌檢查方法

取本品15瓶/3筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共15 g，混勻后，轉(zhuǎn)移至200 ml pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(或含1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)稀釋液中，振搖，經(jīng)薄膜過(guò)濾法處理，用含1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(或pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)作沖洗液分次沖洗(每膜不少于300 ml)，每次100 ml/膜，以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌，依法檢查(中國(guó)藥典2010年版二部附錄ⅪH)，應(yīng)符合規(guī)定。

4 討論

4.1 中和劑的濃度 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者還分別對(duì)1%聚山梨酯80、3%聚山梨酯80、5%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行了考察，試驗(yàn)結(jié)果顯示，三個(gè)濃度的中和劑均有一定的中和作用。但隨著濃度的增加，緩沖液的粘稠度也隨之增強(qiáng)，振搖后，泡沫也隨之更加豐富，對(duì)濾膜過(guò)濾不利。因此，一般情況下，建議選用1% ～3%聚山梨酯80就能滿足此樣品的試驗(yàn)要求。

4.2 中和劑的選擇 本樣品處方中主要成分之一苯扎氯銨為季銨化合物，是目前廣泛應(yīng)用的抗菌劑，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用強(qiáng)，但對(duì)大腸埃希菌、抗酸桿菌等無(wú)效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，聚山梨酯80為非離子表面活性劑，可降低季銨類化合物、酚、醛、對(duì)羥基苯甲酸類、洗必泰類、石炭酸類藥物的活性［3］。利用這一特點(diǎn)，本文通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)建立了以1%聚山梨酯80為中和劑的利多卡因氯己定氣霧劑無(wú)菌檢查方法，結(jié)合薄膜過(guò)濾法，有效去除其抑菌活性。另外，針對(duì)一些藥物存在某些抑菌活性問(wèn)題，在無(wú)菌檢查的過(guò)程中篩選可降低其活性的中和劑的思路，為其他品種藥物中和劑的篩選提供了選擇方向。

［1］中國(guó)藥典 .2010．二部：Appendix，103．

［2］霍秀敏，微生物檢查方法驗(yàn)證與評(píng)價(jià)要求.藥品技術(shù)評(píng)審論壇，2008，3：50．

［3］蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法.北京：華齡出版社，2007：216．