不同氨基酸對精神分裂小鼠BALB/C干預(yù)作用研究

張程希，吳 晶，翟 寅

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

精神分裂癥是一種以基本個性改變，思維、情感和行為的分裂，精神活動與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征的精神疾患，是人類面臨的最為嚴(yán)重的疾病之一，其患病率是精神疾病中最高的一種［1］。病程多呈持續(xù)進展，導(dǎo)致社會適應(yīng)能力的下降甚至精神衰退。精神分裂癥不僅給患者本人造成終身的痛苦，而且給家庭和社會造成長期沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［2］，同時還嚴(yán)重威脅社會的安全與穩(wěn)定。英國科學(xué)家發(fā)表的一項最新研究指出，目前全球罹患精神疾病的人數(shù)不斷上升，這與人類過去半個世紀(jì)的飲食習(xí)慣改變、吃進過多垃圾食物有關(guān)。英國均衡飲食推廣機構(gòu)與英國精神健康基金會發(fā)表的研究報告指出，英國人過去60年間攝取的新鮮蔬果與魚類都較過去少，其中蔬菜消耗量比過去減少了34%，魚的攝入量比60年前減少2/3。相反，人們食用過多飽和性脂肪及糖類，是罹患憂郁癥、精神分裂等精神疾病的重要因素，而加工食品所含毒素與氧化劑也會對腦細胞造成損傷，英國精神健康基金會執(zhí)行官安德魯·麥克洛奇認(rèn)為，對于一些精神病病例而言，改變飲食習(xí)慣較藥物治療和心理治療更為有效［3］。

食品中含有人類所需的不同氨基酸及礦物質(zhì)，由精神分裂癥的谷氨酸假說可知，精神分裂癥患者可能存在著谷氨酸和甘氨酸等氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的不足。甘氨酸是一種主要存在于灰質(zhì)中的神經(jīng)遞質(zhì)，目前對其神經(jīng)傳遞功能研究較少，大部分的甘氨酸抑制途徑發(fā)生在脊髓和髓質(zhì)中。谷氨酸可在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中進行代謝，作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸在神經(jīng)元中不斷被消耗。色氨酸是一種基本氨基酸，且在人腦中無法合成，在機體中它可以利用草酰乙酸作為胺類基團受體進行轉(zhuǎn)氨作用，也可以進行脫羧作用。酪氨酸在腦和腎上腺中的主要代謝途徑是轉(zhuǎn)化成兒茶酚胺。為此，我們通過建立小鼠磷酸可待因精神分裂模型，探索L-谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸，四種氨基酸對精神分裂癥患者的作用，方法及結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 造模藥：醫(yī)用口服磷酸可待因片劑(15 mg/片，國藥集團工業(yè)股份有限公司)，對照組：醫(yī)用口服鹽酸氯丙嗪片(25 mg/片，太原市衛(wèi)星制藥有限公司)，實驗氨基酸：色氨酸(純度≥99%)、甘氨酸(純度≥99%)、酪氨酸(純度≥99%)、L-谷氨酸(純度≥98.5%)均來自Sigma公司。實驗動物：BALB/C小鼠40只［實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0005］，均為雄性，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供。實驗材料：微量注射器(250μl)、灌胃針、鼠籠、燒杯、量筒、自制洞板計數(shù)儀、自制曠場模型、1.5 ml EP管。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸種類選擇 通過查閱文獻［4-8］，從20種基本氨基酸中篩選出可能對精神分裂癥患者有直接或間接作用的氨基酸：L-谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸。

1.2.2 動物分組 將40只小鼠隨機分為10組，每組4只，分別標(biāo)記為空白組，陰性對照組，四種氨基酸的高低劑量組。其中每組小鼠標(biāo)記為1、2、3、4號，前3號為實驗小鼠，4號小鼠為備用鼠，防止小鼠在實驗過程中意外死亡造成數(shù)據(jù)缺失。

1.2.3 動物造模及氨基酸注射 試驗中使用的造模藥為磷酸可待因，預(yù)實驗探索得出其造模用濃度為30 mg/ml，注射量為5μl/g，左側(cè)腹腔注射。對照組為造模后灌胃注射氯丙嗪，濃度為0.33 mg/ml，注射量0.1 ml?？瞻捉M為造模后灌胃注射生理鹽水。四種高低濃度氨基酸注射量分別為每次0.1 ml/只，每只灌胃注射一次，注射后放入準(zhǔn)備好的鼠籠中，10 min后，造模及注射完成(造模用磷酸可待因及對照組氯丙嗪試驗濃度及劑量均為實驗者探索得出)。氨基酸的用量參照人體氨基酸的正常攝入量計算［5］，分別為色氨酸 11.4 mg/kg、谷氨酸 40 mg/kg、酪氨酸 45.3 mg/kg、甘氨酸 5 mg/kg。根據(jù)實驗用BALB/C小鼠的平均質(zhì)量換算得出待測氨基酸的濃度。

1.2.4 曠場實驗 通過灌胃給予正常小鼠系列劑量的實驗氨基酸溶液。然后將小鼠放回飼養(yǎng)盒中，10 min后將小鼠放置于尺寸48 cm×24 cm×20 cm、頂部開口的長方形實驗盒內(nèi)，盒上覆蓋無色透明玻璃；對小鼠在盒內(nèi)的行為進行錄像。觀看并分析，做出整個檢測期間在2 h內(nèi)的刻板行為時間以及快速運動的次數(shù)，評定記錄待篩選氨基酸對正常小鼠的行為產(chǎn)生的影響［6］。

1.2.5 洞板實驗 將小鼠分為對照組和實驗組；造模后，分別給予小鼠不同的高低劑量氨基酸；將小鼠放置于洞板平臺中央，即開始計時，讀取該小鼠3 min內(nèi)的探洞次數(shù)［6］。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果采用配對樣本t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 利用磷酸可待因造模后，小鼠在曠場中出現(xiàn)刻板性動作并伴有不時的快速移動；洞板實驗中，小鼠天生好奇型的探洞行為明顯減少，學(xué)習(xí)和記憶功能下降。造模結(jié)果符合精神分裂癥的陰性癥狀，如情感淡漠和運動機能障礙。

2.2 曠場實驗結(jié)果 見表1，空白模型組刻板行為時間為(361.00±24.02)s，快速移動次數(shù)(8.75±2.31)次，氯丙嗪對照組刻板行為時間約為(161.33±16.17)s，快速移動次數(shù)(4.00±1.00)次，即對照組實驗結(jié)果幾乎是空白組的一半。由L-谷氨酸高低劑量刻板行為時間和快速移動次數(shù)，均說明L-谷氨酸高低劑量組灌胃給藥后有效緩解BALB/C小鼠的緊張度，和對照組氯丙嗪有著相似的緩解精神分裂癥狀的作用，其中以L-谷氨酸高劑量組效果更為顯著。同理，酪氨酸高低劑量組刻板行為時間和快速移動次數(shù)較空白模型組大幅增加，即小鼠緊張度增加，說明酪氨酸對精神分裂癥有促進作用，見表2。

2.3 洞板實驗結(jié)果 見表1，空白模型組小鼠探洞次數(shù)為(7.67±0.58)次，對照組小鼠探洞次數(shù)為(22.33±2.52)次，對照組探洞實驗結(jié)果幾乎是空白組的3倍，說明氯丙嗪對緩解精神分裂有著較顯著的作用。L-谷氨酸高低劑量洞板實驗小鼠探洞次數(shù)分別為(22.67±1.53)次和(26.00±2.65)次，由表1可見，分別注射L-谷氨酸高低劑量后小鼠探洞次數(shù)明顯增加，說明學(xué)習(xí)性行為恢復(fù)。因此，L-谷氨酸高低劑量和對照組氯丙嗪有著相似緩解精神分裂癥狀的作用。同理，酪氨酸高低劑量組探洞次數(shù)減少，即小鼠情緒更加淡漠，學(xué)習(xí)型行為近乎喪失，說明酪氨酸對精神分裂癥有促進作用，見表2。

表1 高低劑量氨基酸對小鼠精神分裂刻板行為、快速移動次數(shù)、模型洞板實驗的影響()

表1 高低劑量氨基酸對小鼠精神分裂刻板行為、快速移動次數(shù)、模型洞板實驗的影響()

注：以上數(shù)據(jù)均已根據(jù)不同小鼠計數(shù)，求取加權(quán)平均數(shù)記錄并計算。與空白模型組比較，*P＜0.05；與氯丙嗪對照組比較，▲P＜0.01

表2 高低劑量氨基酸對精神分裂小鼠干預(yù)作用百分比(%)

3 討論

近年來，精神分裂癥的谷氨酸假說越來越受到精神醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，研究者特別意識到谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體系統(tǒng)在精神分裂癥病理機制中的潛在作用。精神分裂癥谷氨酸假說認(rèn)為：精神分裂癥患者存在腦內(nèi)谷氨酸NMDA受體功能減退，這種狀況可因使用NMDA受體拮抗劑而導(dǎo)致原本正常的人或動物大腦的神經(jīng)功能產(chǎn)生功能減退的變化。方貽濡等［7］認(rèn)為，谷氨酸是影響認(rèn)知功能的一個重要因素，谷氨酸受體(Glu-R)可以選擇性地與遞質(zhì)受體結(jié)合，激活N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDA-R)，使鈣通道開放，鈣離子內(nèi)流增加，調(diào)節(jié)著興奮性突觸的傳遞，參與學(xué)習(xí)和記憶的形成。

臨床研究表明，在慢性分裂癥患者腦內(nèi)，至少有6個腦區(qū)(運動前區(qū)、感覺區(qū)、緣上回、角回、視覺皮質(zhì)及視覺聯(lián)絡(luò)皮質(zhì))的甘氨酸受體結(jié)合量增加。劉鐵榜等［8］提出，精神分裂癥患者腦脊液中甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸的濃度顯著高于正常人，提示精神分裂癥患者腦脊液中氨基酸濃度的變化數(shù)據(jù)可作為研究對精神失常有干預(yù)作用的重要依據(jù)。因此，本文初步篩選用色氨酸、谷氨酸、酪氨酸和甘氨酸作為實驗用氨基酸。目前記載的造模方法分為藥物造模和非藥物造模。藥物造模主要選用地卓西平馬來酸鹽、苯丙胺、苯環(huán)己哌啶、致幻劑、神經(jīng)毒素等造?；蛴冒銌岱日T導(dǎo)小鼠攀爬行為模型。本次試驗采用的磷酸可待因造模精神分裂，機理與藥物造模中MK801模型類似，但主要引發(fā)小鼠精神分裂癥陰性癥狀，如情感淡漠和運動機能障礙。

曠場實驗是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法，操作簡便，方法可靠。計算機技術(shù)和圖像處理技術(shù)的引入，使動物行為分析的檢測指標(biāo)大為增加，具有高效、無創(chuàng)、靈敏、客觀等諸多優(yōu)點。洞板實驗是基于小鼠喜歡探洞的天性而設(shè)計的，它能有效反映小鼠對新環(huán)境的探索能力。Kamei等［9］認(rèn)為，測試時間內(nèi)精確記錄每個洞穴的進入次數(shù)，可量化地反映小鼠對外界的好奇心，考察小鼠的認(rèn)知能力，也可以有效地分析出小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能變化。

精神分裂造模成功后的BALB/C小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能明顯受損，刻板性行為增加，并且探洞次數(shù)下降，常常多次探身進入同一個洞。根據(jù)曠場實驗和洞板實驗的結(jié)果，初步發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸對精神分裂癥狀有明顯緩解的作用(P＜0.05)，效果堪比對照藥物氯丙嗪，高濃度L-谷氨酸實驗效果更為明顯。而酪氨酸顯現(xiàn)出明顯的促進精神失常發(fā)病作用(P＜0.01)。高低濃度的色氨酸對精神失常則幾乎沒有干預(yù)作用。低濃度甘氨酸表現(xiàn)出輕微減輕精神失常的效果，但高濃度甘氨酸反而具有加重患病作用，這可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，有待進一步探究。

隨著來自生活和工作的壓力的不斷增大以及環(huán)境、社會因素和不良飲食習(xí)慣等因素的逐漸增加，很多人患有不同程度的精神失常，然而現(xiàn)在治療的藥物價格不菲，而且都有一定的不良反應(yīng)。因此找到一種有效的、讓更多人能夠在經(jīng)濟上接受且健康有益的療法和預(yù)防措施就顯得極為重要。

在以上篩選的氨基酸中，興奮性氨基酸(L-谷氨酸)對精神分裂癥狀有明顯緩解效果，且高濃度L-谷氨酸實驗效果更為明顯。而酪氨酸則顯現(xiàn)出顯著的促進精神失常發(fā)病的作用。因此，為預(yù)防和緩解精神失常，建議人們?nèi)粘Ｉ钪性谝欢ㄏ薅葍?nèi)多食用含有谷氨酸的食物，如西紅柿、芝士、蘑菇、黍米、青豆等，同時應(yīng)盡量避免過多攝入含有酪氨酸的食物，如某些豆類、瘦肉、及動物內(nèi)臟等。

［1］李文君.精神分裂癥候選基因的遺傳學(xué)研究［D/OL］.中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，吉林大學(xué)，2008.http：//cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10183-2008126880.htm.

［2］鐘慧軍，劉軍紅，彭 亮，等.多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)多態(tài)性與精神分裂癥的相關(guān)性［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，10(17)：3231-3234.

［3］吃垃圾食品影響腦部健康［N］.江門日報，2007-8-22(B4版).

［4］王一芳，石海明，焦冬生，等.杏仁核毀損范圍與難治性精神分裂癥療效的關(guān)系探討［J］.東南國防醫(yī)藥，2007，9(3)：169-171.

［5］顧景范.人體氨基酸需要量［J］.氨基酸和生物資源，1979，2：28-34.

［6］丁 澄，金玫蕾.精神分裂癥動物模型的拓展及在相關(guān)基因和藥物篩選中的應(yīng)用［D/OL］.中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，中國科學(xué)院研究院(上海生命科學(xué)研究院)，2005.http：//cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-80100-2005098886.htm.

［7］方貽儒，王祖承.精神分裂癥的谷氨酸假說［J］.上海精神醫(yī)學(xué)，2004，16(1)：43-45.

［8］劉鐵榜，章 華，臧德馨.精神分裂癥與興奮性氨基酸［J］.國外醫(yī)學(xué)：精神病學(xué)分冊，1994，21(3)：129-134.

［9］Kamei J，Matsunawa Y，Miyata S，et al.Effects of nociceptin on the exploratory behavior of mice in the hole-board test［J］.Eur J Pharmac，2004，489(1-2)：77-87.