術后鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞陽離子蛋白及趨化因子的變化

施祝良，張學淵，黃 潔

(本文編輯:潘雪飛; 英文編輯:王建東)

嗜酸性粒細胞的聚集、活化被認為與鼻腔內黏膜水腫、息肉形成密切相關。我們選擇慢性鼻-鼻竇炎不伴息肉(chronic sinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者術后黏膜轉歸過程為研究對象［1］。通過對手術患者鼻腔黏膜組織中嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)及嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)動態變化的研究，探討嗜酸性粒細胞聚集、活化與鼻內鏡術前、術后鼻腔黏膜轉歸的關系，為鼻內鏡術后的治療提供依據，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例分組及取材 選取2005年3月至6月我科收治的CRSsNP患者10例為研究對象，所有病例均于術前(術前組)、術后1～2周(術后A組)、術后4～6周(術后B組)及術后10～12周(術后C組)取上頜竇口周邊水腫的鼻黏膜組織進行檢測。對照組為10例同期鼻中隔偏曲或單純上頜竇囊腫患者的中鼻甲黏膜(含有少量嗜酸性粒細胞的鼻腔黏膜)。上述標本離體后迅速于液氮中保存備用。鼻內鏡術前停用鼻噴激素1周，術中處理泡狀中鼻甲、嚴重鼻中隔偏曲等明顯的局部病變，通暢鼻竇引流，手術前后合理使用抗生素，不使用鼻噴激素。

1.2 實驗試劑 Immulite化學發光分析儀及配套試劑購自美國DPC公司；大鼠抗人eotaxin多克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產品；辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠的二抗為北京中山生物技術有限公司產品；RIPA蛋白提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產品。

1.3 檢測方法

1.3.1 鼻黏膜組織的裂解及組織總蛋白的測定采用文獻［2］方法測定。

1.3.2 鼻黏膜組織中ECP的表達 采用文獻［2］方法測定。

1.3.3 鼻黏膜eotaxin的表達 用Western-blot檢測。取上述方法提取的組織上清液用N-3(羥甲基)甲基甘氨酸-甘氨酸系統電泳，電轉移至0.22 μm硝酸纖維素膜，該膜經含1%牛血清的三羥甲基氨基甲烷生理鹽水緩沖液(50 mmol pH 7.5)振搖2 h，于4℃封閉過夜后，與大鼠抗人eotaxin多克隆抗體(稀釋度1∶500)在4℃下孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠的二抗(稀釋度1∶500)室溫下孵育90 min，最后經ECL發光試劑盒顯影，X線膠片記錄結果，用quantity one Version 4.4軟件測定蛋白條帶的積分密度(IOD)。

1.4 統計學處理 應用統計軟件SPSS 11.0對計量數據行單因素方差分析，SNK法兩兩比較，兩組數據分別進行正態性檢驗；并行直線相關性分析；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

ECP及eotaxin鼻內鏡術后隨時間呈現如下變化規律：①術后1～2周較術前病變黏膜組明顯降低；②術后4～6周達高峰，基本恢復至術前水平；③術后10～12周回落，接近于術后1～2周水平。④手術前后鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表達呈正相關，相關系數γ=0.719，P=0.004。見表1。

3 討論

鼻內鏡術后黏膜上皮化是一個動態而較長之過程，約需3～6個月時間，期間會出現鼻腔黏膜水腫、囊泡、小息肉，有部分患者不能完成黏膜上皮化，鼻竇炎再次發作；其機制不太明晰，與此相關的細胞因子研究文獻不多［3］。本研究通過對鼻內鏡手術前后不同時期鼻黏膜組織中和ECP和eotaxin表達的測定，試圖從分子水平探討嗜酸性粒細胞聚集活化對鼻內鏡術后鼻腔黏膜上皮化的影響，為鼻內鏡術后的治療提供一定的理論依據。

表1 手術前后鼻黏膜組織中ECP及eotaxin含量的變化()

表1 手術前后鼻黏膜組織中ECP及eotaxin含量的變化()

注：*為ECP含量與組織總蛋白的含量之比/10-6。與術前組比較，#P＜0.05；與術后C組比較，▲P＞0.05

ECP含量代表嗜酸性粒細胞的活性［2，4］。其生物活性主要表現在細胞毒性和非細胞活性兩方面。細胞毒性表現為ECP對細胞膜具有破壞作用，在被攻擊的細胞膜上形成小孔，使水分子等小分子物質可自由通過，細胞因滲透壓下降腫脹壞死；非細胞活性在呼吸道炎癥中主要表現為刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺、呼吸道黏液分泌增加。eotaxin被認為是目前為止發現的唯一能有效選擇性激活嗜酸性粒細胞的細胞因子，也被認為對嗜酸性粒細胞趨化作用最強的細胞因子之一［5］。eotaxin在鼻腔黏膜中增多時，表明局部嗜酸性粒細胞增多，并被激活，活化的嗜酸性粒細胞脫顆粒，ECP分泌也隨之增加；ECP的攻膜作用使更多的嗜酸性粒細胞溶解，嗜酸性粒細胞內的eotaxin釋放，因而ECP及eotaxin在鼻黏膜病變中具有相互促進作用［6-7］。

本實驗提示，術后初期鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表達較術前明顯降低，可能是因為剛手術后鼻腔內病變黏膜及其所包含的炎癥細胞、細胞因子明顯減少；另外，鼻內鏡手術是一個創傷，術后患者應激性腎上腺皮質激素升高，抑制鼻腔嗜酸性粒細胞炎癥的發展和細胞因子的表達。術后4～6周ECP及eotaxin的表達明顯高于術后10～12周組。表明此期鼻腔黏膜中有較多的嗜酸性粒細胞浸潤，且其活性較高。嗜酸性粒細胞被激活后分泌細胞因子增加，由于當時鼻腔黏膜尚未完成上皮化，纖毛功能恢復不全，不能形成“黏液毯”［8］，包括 eotaxin在內的細胞因子不能及時帶走，進而募集并激活以嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞，這些炎性細胞又分泌各類細胞因子，形成“自我放大”，所以eotaxin表達較多，手術區黏膜水腫明顯，部分呈息肉樣變［9］。術后2～3個月，鼻腔局部炎癥消退，大部分患者鼻腔黏膜逐步完成上皮化。

本實驗提示，鼻內鏡術后鼻腔黏膜中 ECP、eotaxin的表達呈現動態變化，與鼻腔黏膜的修復轉歸過程相對應；在臨床上，應該加強這段時期的治療(換藥、沖洗、局部用藥)，以利盡早完成術后鼻腔黏膜組織的修復［10］。

［1］中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會，中華醫學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組.慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南［J］.中國臨床醫生，2010，38(4)：73-74.

［2］施祝良，張學淵.嗜酸性粒細胞陽離子蛋白在鼻內鏡術鼻腔黏膜轉歸過程中的表達［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19(14)：627-628.

［3］王鵬舉，沈 瑩.慢性鼻竇炎患者手術前后血清表皮生長因子含量的變化［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25(2)：49-50.

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［9］夏忠芳，孔維佳，樂建新，等.鼻息肉組織及上皮細胞的形態學特征與嗜酸性粒細胞陽離子蛋白的表達［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，22(17)：787-789.

［10］關志華，陳立萍，黃超洋，等.鼻后滴漏綜合征治療的臨床研究［J］. 東南國防醫藥，2011，13(3)：234-235.