DNA高甲基化與腫瘤的研究進展

李燦美 綜述 楊 凌，曾 云 審校

（昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液科，云南 昆明 650032）

在哺乳動物DNA分子中，DNA甲基化是指甲基（-CH3）在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs） 催化下，共價結(jié)合到DNA分子的胞嘧啶（C）堿基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的表觀遺傳學(xué)修飾過程。DNA甲基化發(fā)生在DNA復(fù)制完成之后，因此不改變DNA序列，是一種可逆的變化[1]，是通過影響基因的表達以改變其功能。DNA異常甲基化分為DNA高甲基化和DNA低甲基化。研究證實，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中DNA高甲基化比低甲基化更為常見。DNA高甲基化是癌變過程中早期的分子異常之一,也是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的潛在生物學(xué)標志，其對腫瘤患者的早期檢測、治療和預(yù)后等都有重要意義。因此，本文將對DNA高甲基化與腫瘤的相關(guān)研究進展進行綜述。

一、DNA高甲基化產(chǎn)生的原因

導(dǎo)致腫瘤高甲基化模式改變的機制尚不清楚，其可能和以下因素有關(guān)：⑴保護胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤島（CpG島）免受甲基化因子的丟失。在正常細胞中，多數(shù)基因啟動子區(qū)通常處于非甲基化狀態(tài)，這可能和一些保護性因子如反式作用因子等的存在有關(guān)。Butcher等[2]報道：反式作用因子與CpG島起始點的Sp1位點結(jié)合可防止乳腺癌易這個結(jié)果提示某些反式作用因子可保護CpG島免于甲基化。因此，在感基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1） 啟動子甲基化，缺乏CpG島保護因子的情況下將導(dǎo)致甲基化狀態(tài)的出現(xiàn)。⑵腫瘤中DNMTs的過度表達。研究發(fā)現(xiàn)DNMTs,尤其是DNMT1在腫瘤組織中表達水平升高,這提示DNMTs與腫瘤中的甲基化異常有關(guān),并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。⑶DNMTs復(fù)合物受到破壞，即指DNMTs酶的抑制成分的調(diào)節(jié)失控，該失控可能與DNMTs形成復(fù)合物的一種或幾種因子如：視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1相關(guān)蛋白-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合蛋白（DMAP1-DNMT結(jié)合蛋白）的丟失所致。⑷基因組各部分復(fù)制時序性的破壞。基因組的復(fù)制在細胞周期S期通過空間和短暫模式得以實現(xiàn)。在此過程中的變化使復(fù)制區(qū)域和染色質(zhì)構(gòu)成的區(qū)域無法正常地相互作用。CpG島可能通過復(fù)制時序紊亂發(fā)生異常甲基化。

二、DNA高甲基化導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機制

在正常狀態(tài)下基因啟動子區(qū)的CpG島一般是非甲基化的，當(dāng)其發(fā)生高甲基化時，常導(dǎo)致抑癌基因、DNA修復(fù)基因等轉(zhuǎn)錄沉默，使之功能喪失，從而導(dǎo)致正常細胞的生長分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時修復(fù)，這與多種腫瘤形成密切相關(guān)。

1.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因高甲基化：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1） 是造血細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本負調(diào)控因子，90%的成人T淋巴細胞白血病，90.9%的自然殺傷細胞/T細胞淋巴瘤，60.5%的急性淋巴細胞白血病，90.0%的急性髓系白血病，100%的慢性粒細胞白血病的患者標本中有SHP-1基因CpG區(qū)域高甲基化[3]。Yang等[4]研究51例肝細胞癌組織中多個相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果多基因發(fā)生甲基化：細胞因子信號抑制因子1（SOCS1）（65%），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 P（GSTP）（54%），促后期復(fù)合物（APC）（53%），E-鈣粘蛋白（CDH1）（49%）及 p15（49%），其中 53%的肝細胞癌有2個以上的基因高甲基化，而在正常組織中為0%。證明，SOCS1等的高甲基化是肝細胞癌發(fā)生過程中的普遍事件，且對腫瘤形成起到重要作用。

2.抑癌基因高甲基化：研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因p16的失活通常都采用CpG島高甲基化的作用機制。高甲基化導(dǎo)致p16基因失活是腫瘤中經(jīng)常發(fā)生的事件之一。Celebiler Cavusoglu等[5]對p16和CDH1的研究表明，浸潤性乳腺癌的腫瘤組織和其周圍正常的乳腺組織在這2個基因中的甲基化表達存在差異而這種差異還存在于在腫瘤周圍的正常乳腺組織和無腫瘤的正常乳腺組織之間。研究發(fā)現(xiàn)，在許多血液腫瘤中可以檢測到抑癌基因p15的高甲基化。如：Martin等[6]發(fā)現(xiàn)p15基因的異常與漿細胞疾病有關(guān)，在多發(fā)性骨髓中p15基因高甲基化是重要的事件；在各種類型的急性白血病、慢性髓細胞性白血病、前髓性白血病、成淋巴細胞性白血病和淋巴瘤中都有p15基因啟動子區(qū)的甲基化。

3.DNA修復(fù)基因的高甲基化：在腫瘤中，可以發(fā)現(xiàn)參與DNA修復(fù)的基因常由于啟動子區(qū)高甲基化而失活。如：DNA修復(fù)基因O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-MGMT）近來的研究證明存在于該基因啟動子區(qū)或第一外顯子內(nèi)的CpG島甲基化與其轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，而且這種變化可以使染色質(zhì)進入關(guān)閉狀態(tài)，進而導(dǎo)致核小體定位異常。該變化不僅存在于細胞系中，也發(fā)生在原位癌中，在肺癌、乳腺癌、大腸癌和淋巴瘤細胞系中O6-MGMT啟動子出現(xiàn)高甲基化。研究證明，BRCA1發(fā)生高甲基化可能與DNA雙鏈斷裂，轉(zhuǎn)錄和重組修復(fù)有關(guān)，這一理論在乳腺癌和卵巢癌中都得到證實[7]。

除上述基因外，還發(fā)現(xiàn)其他一些基因，如凋亡基因（死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK[8]），視黃酸受體 β（RAR-β），微小 RNA （miRNA）[9]，血管生成抑制基因（THBS1）[10]等在不同腫瘤中存在著高甲基化現(xiàn)象。提示腫瘤的發(fā)生與不同基因發(fā)生高甲基化有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

三、DNA高甲基化的臨床意義

隨著在癌癥的發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化異常現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，且此現(xiàn)象在確診前就能被檢測出，提示某些基因的DNA高甲基化水平的檢測有望成為腫瘤早期診斷的潛在指標，甚至可以作為患病風(fēng)險預(yù)測、臨床病程監(jiān)控和療效評估的指標。同時，DNA甲基化是可逆的，因此，使用去甲基化劑使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表達，為腫瘤的治療提供了新的方法。

1.DNA高甲基化與腫瘤的早期診斷：隨著甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)，使我們能夠?qū)εR床上的微量樣本進行檢測，如血漿、唾液、痰液等。因此，人們已開始探討以體液DNA作為DNA甲基化臨床分析樣品，期望可早期診斷腫瘤，如采用大便進行結(jié)腸癌診斷分析，痰液診斷肺癌，取血清或血漿DNA診斷各種實體腫瘤[11]。有報道p16INK4a在肺癌發(fā)病早期（輕度異型增生階段）其啟動子CpG島即呈高甲基化狀態(tài)。Palmisano等報道，在臨床診斷肺鱗癌的前3年，他們就在患者的痰液中檢測出p16和O6-MGMT基因甲基化。因此，痰液中某些基因的異常甲基化可作為臨床篩查肺癌高危人群的一個指標。因此，隨著研究的不斷深入，DNA高甲基化將在腫瘤的早期診斷方面發(fā)揮重要作用。

2.DNA甲基化與腫瘤預(yù)后判斷：隨著對甲基化與腫瘤發(fā)展相關(guān)性研究的不斷深入，人們逐漸認識到，甲基化改變與傳統(tǒng)的預(yù)后指標之間存在密切聯(lián)系。主要包括以下4個方面：⑴甲基化改變與腫瘤分級、分期有明顯的相關(guān)性。如Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常見，在結(jié)直腸癌Dukes分期C和D的病例中p16的甲基化率比A和B的高。⑵DNA異常甲基化可促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。乳腺癌中細胞周期素蛋白D2（CyclinD2），RAR-β，RASSF1A和HIN-1（high innormal-1） 的甲基化改變與淋巴結(jié)、骨、腦、肺轉(zhuǎn)移有關(guān)。⑶甲基化可作為腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子。如口腔鱗狀細胞癌時存在 RECK（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs） 基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高[12]。⑷甲基化影響生存期。Fischer等[13]研究了惡性間皮胞瘤中3個基因的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)多基因較單個基因甲基化預(yù)后更差。膀胱癌中APC，GSTP1基因發(fā)生異常甲基化時，患者存活時間明顯縮短。可見檢測甲基化的改變有助于判斷預(yù)后，進而為臨床上的病情監(jiān)控和風(fēng)險評估提供依據(jù)。

3.DNA甲基化譜的建立和意義：Esteller等[14]對以往有關(guān)甲基化的部分工作進行了分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)腫瘤類型可以建立CpG島甲基化圖譜。腫瘤細胞在很大程度上保持其細胞譜系的特征（基因表達和甲基化模式），故對腫瘤細胞DNA甲基化譜式的分析將為確定腫瘤組織來源提供必要的信息。因此，人類表觀遺傳協(xié)會（HEC）于2003年提出和開始實施全面揭示人類基因組所包含的表觀遺傳學(xué)完整信息，繪制人類基因組甲基化可變位點 （methylation variable positions，MVP） 圖譜。以MVP為代表的表觀基因組圖譜，將有助于了解基因調(diào)控，以及正常和疾病狀態(tài)下不同基因相互作用的千絲萬縷關(guān)系。它不僅可為腫瘤等疾病的深入研究提供新的詮釋依據(jù)，而且，與其他基因組技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，還可深入到藥物研究，此外，DNA甲基化篩選還可為疾病狀態(tài)提供新的表觀遺傳學(xué)標記，為藥物研發(fā)挖掘新的標靶。

4.甲基化在臨床治療上的應(yīng)用：由于DNA甲基化不涉及到DNA序列本身的改變，所以這種改變是可逆的，因此，使用去甲基化劑使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表達。研究已證實去甲基化酶抑制劑5-脫氧雜氮胞苷（5-aza-CdR） 在體內(nèi)、外均可使大多數(shù)高甲基化的抑癌基因去甲基化恢復(fù)表達而抑制腫瘤。Momparler等[15]報道5-Aza-CdR在患有白血病、骨髓增生異常綜合征（MDS）、非小細胞性肺癌（NSCLC）的病人中進行了1期、2期臨床試驗，顯示了一定的抗腫瘤作用，可以提高一部分患者的生存率。因此，5-aza-CdR和5-氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine），于2007年獲得FDA批準用于MDS患者的治療[16]。目前在國外5-aza-CdR是治療MDS推薦的一線藥物[17]。Miasaki等[18]研究顯示5-aza-2-deoxycytidine治療后的甲狀腺癌細胞系，維甲酸受體beta2重新表達和生長抑制。Fan等[19]研究結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用組蛋白去乙酰化酶抑制劑和DNMTs抑制劑可以恢復(fù)ERalpha陰性乳腺癌細胞株對內(nèi)分泌治療的敏感性。Yang[20]等用三氧化二砷處理淋巴瘤T2細胞株，使SHP-1基因去甲基化而再表達。因此，在腫瘤和癌前病變中通過去甲基化處理可以恢復(fù)某些關(guān)鍵性抑癌基因的功能，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。所以，在將來，DAN甲基化抑制劑將作為抗癌制劑在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)然對這些藥物的作用和副作用還需要進行更深人的基礎(chǔ)和臨床試驗研究，因為廣泛應(yīng)用去甲基化藥物可以啟動一些使細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因。

四、尚待解決的問題和展望

目前，DNA甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活的機制已基本明確，但惡性腫瘤中DNA甲基化改變的原因尚未完全清楚。不同的惡性腫瘤中可能存在不同的甲基化譜，同一腫瘤的癌前病變、早期癌以及中晚期癌的甲基化譜有無改變，尚不得而知。雖然DNA高甲基化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系較明確，但腫瘤發(fā)生是一個多因素、多階段、多基因的復(fù)雜過程。DNA高甲基化如何與其它致癌因素協(xié)同作用促進腫瘤發(fā)生仍需進一步研究。由于目前已知的與腫瘤相關(guān)的甲基化基因數(shù)量非常龐大，所以，即便CpG島甲基化譜具有腫瘤特異性，且大多數(shù)腫瘤都有多個獨立的啟動子甲基化事件，建立合理的多指標甲基化圖譜就能為評估腫瘤風(fēng)險、早期診斷以及腫瘤預(yù)后提供有用信息，但如何既經(jīng)濟又有效地對細胞全基因組甲基化狀態(tài)進行檢測，早期發(fā)現(xiàn)異常甲基化的DNA，也成為DNA甲基化研究中一項非常重要的工作。

同時，目前對疾病診斷的金標準仍然是依靠病理組織學(xué)的診斷，但這需要手術(shù)或活檢來獲得標本，而獲得這些標本的過程均是有創(chuàng)的，因此對于那些不能耐受手術(shù)檢查或者不具備相應(yīng)檢查條件的患者，有創(chuàng)檢查對于早期發(fā)現(xiàn)和篩選腫瘤不適用。腫瘤相關(guān)基因啟動子異常甲基化是細胞癌變過程中的一個早期事件，可以作為腫瘤發(fā)生的敏感性生物標志物。因此，如何有效地利用比較容易獲得一些生物樣品如外周血的血漿/血清、唾液、痰、尿、糞便等來檢測腫瘤組織中存在的腫瘤相關(guān)基因的啟動子高甲基化，是醫(yī)務(wù)工作者的當(dāng)務(wù)之急和研究方向。

盡管，體外實驗已證實甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR通過去甲基化作用可使多種CpG島高甲基化的抑癌基因重新表達而恢復(fù)抑癌功能。但是這些藥物均無基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會引起整體的低甲基化；這類藥物的活化作用可逆，療效依賴于藥物的持續(xù)存在；同時在大劑量應(yīng)用時會對正常細胞有毒副作用。因此，我們還應(yīng)該在逆轉(zhuǎn)基因甲基化的特異性、療效的持續(xù)性、可控制性等方面進一步研究。

［1］TAHILIANI M,KOH KP,SHEN Y,et al.Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydro-xymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1[J].Science,2009,324（5929） :930-935.

［2］BUTCHER DT,MANCINIDN,ARCHER TK,et al.DNA bindingsites for putative methylation boundaries in the unmethylated region ofthe BRCA1 promoter[J].Int J Cancer,2004,111（5):669-678.

［3］韓穎,羅建民,賈曉輝,等.白血病患者造血細胞磷酸酶與半胱氨酸蛋白酶基因表達及其臨床意義[J].中華內(nèi)科雜志,2006,45(5):363－365.

［4］YANG B,GUO MZ,HERMAN JG,et al.Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppress or genes in hepatocellular carcinoma[J].AmJ Pathol,2003,163(3):1101－1107.

［5］CELEBILER-CAVUSOGLUA,SEVINCAI,SAYDAMS,et al.Promoter methylation and expression changes of CDH1 and P16 genes in invasive breast cancer and adjacent normal breast tissue[J].Neoplasma,2010，575:465－472.

［6］MARTIN P,GARCIA-COSIO M,SANTON A,et al.Aberrant gene promoter methylation in plasma cell dyscrasias[J].Exp Mol Pathol,2008,84(3):256－261.

［7］RAKHA EA,El-SHEIKH SE,KANDIL MA,et al.Expression of BRCA1 protein in breast cancer and its prognostic significance[J].HumPathol,2008,39(6):857－865.

［8］MICHIE AM,MCCAIGAM,NAKAGAWAR,et al.Deathassociated protein kinase(DAPK)and signal transduction:Regulation in cancer[J].FEBSJ,2010，227，74－80.

［9］NAGELR,SAGE CL,DIOSDADO B,et al.Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the mir-135 family in colorectal cancer[J].Cancer Res,2008,68:5795－5802.

［10］KIOULAFA M,KAKLAMANIS L,MAVROUDIS D,et al.Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer[J].Clin Biochem,2009,4210:970－978.

［11］IBANEZ DE,CACERES I,CAIRNS P.Methylated DNA sequences for early cancer detection,molecular classification and chemotherapy response prediction[J].Clin Transl Oncol,2007,9(7):429－437.

［12］LONGN K,KATO K,YAMASHITA T,et al.Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis oral squamous cell carcinomas[J].Oral Oncol,2008,44(11):1052－1058.

［13］FISCHER JR,OHNMACHT U,RIEGER N,et al.Promoter methylation of RASSF1A,RARBETA and DAPK predict poor prognosis of patients with malignant mesothelioma[J].LungCancer,2006,54(1):109－116.

［14］ESTELLER M.Epigenetics in cancer[J].N Engl J Med,2008,358:1148－1159.

［15］MOMPARLER RL.Epigenetic therapyofcancer with 5-aza-2-deoxycytidine(decitabine)[J].Semin Oncol,2005,32(5):443－451.

［16］ATALLAH E,GARCIA-MANEROG.Use ofhypomethylating agents in myelodysplastic syndromes[J].Clin Adv Hematol Oncol,2007,5(7):5445－5452.

［17］YANG X,LAY F,HAN H,et al.TargetingDNA methylation for epigenetic therapy[J].Trends Pharmacol Sci,2010,31(11):536－546.

［18］MIASAKI FY,VIVALDI A,CIAMP IR,et al.Retinoic acid receptor beta reexpression and growth inhibition in thyroid carcinoma celllines after 5-aza-2-deoxycytidine treatment[J].J Endocrinol Invest,2008,31(8):724－730.

［19］FAN J,YIN WJ,LU JS,et al.ER alpha negative breast cancer cells restore response to endocrine therapy by combination treatment with both HDAC inhibitor and DNM T inhibitor[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(8):883－890.

［20］YANG L，LUO JM，WEN SP,et al.Effect of As2O3 on demethylation ofSHP-1 gene in human lymphoma cell line T2[J].Chin J Cancer，2009，28(3)：209－213.