熒光PCR快速檢測艱難梭菌

吳勁松 浙江省湖州市南潯人民醫院檢驗科 湖州 313000

艱難梭菌（clostridium difficile，CD）又稱難辨梭狀芽孢桿菌，是一種厭氧革蘭染色陽性芽孢桿菌，廣泛分布于自然環境及動物和人的糞便中，主要通過糞-口途徑傳播[1-2]。艱難梭菌是引起醫源性腹瀉的重要病原菌，與大量抗生素使用有關，其感染典型表現是偽膜性腸炎[3-4]。目前全球特別是歐洲和北美艱難梭菌感染的流行暴發迅速增多，嚴重病例數、復發率和病死率均明顯上升，耐藥菌株也在增多，給該病的臨床診斷和治療提出新的挑戰[5]，因此臨床實驗室對其快速而準確的識別、鑒定具有重要意義。筆者采用實時熒光PCR方法對艱難梭菌進行快速檢測鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌 株 艱難梭菌標準菌株（ATCC9689）及其它引起腹瀉致病菌如福氏志賀菌ATCC51311，空腸彎曲菌ATCC33560，產單核李斯特菌ATCC7644，霍亂弧菌ATCC16026，腸出血性大腸埃希菌O157：H7 ATCC43889，沙門菌 ATCC50041／ATCC14028，副溶血性弧菌ATCC20506。均購于中國微生物菌種庫。

1.2 糞便標本 278例糞便標本均來自我院2010年1月—2010年12月住院腹瀉患者，所有標本采集后均保存于4℃，并在4h內完成檢測。

1.3 艱難梭菌毒素檢測 采用法國生物梅里埃公司的VIDAS難辨梭菌毒素檢測試劑對上述糞便標本艱難梭菌感染情況進行分析。

1.4 基因組DNA提取 菌株基因組DNA提取采用Promega公司WizardGenomic DNA Purification Kit試劑盒，糞便基因組提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA stool Mini Kit試劑盒，按照操作說明進行。

1.5 熒光定量PCR 根據艱難梭菌TcdB基因序列采用Primer Express3.0軟件（ABI）設計特異性引物和探針，上游引物：5’-GAAAGTCCAAGTTTACGCTCAAT-3’；下游引物：5’-GCTGCACCTAAACTTACACCA-3’；熒光探針：5’-FAM-ACAGATGCAGCC AAAGTTGTTGAATT-TAMRA-3’。按照以下體系配制反應液：5.0μL10×PCR buffer，7.0μL 25mM Mg2+，4.0μL 2.5mM dNTP，10μM 上下游引物各 2.0μL，10μM 熒光探針 0.5μL，5U/μL Taq 酶 1.0μL，模板DNA 5.0μL，雙蒸水補足 50μL；在 ABI7000 熒光定量 PCR 儀上按照 94℃變性 5min，94℃15s、60℃60s的循環條件擴增40個循環后觀察分析結果。

1.6 標準品構建 將PCR擴增產物純化后連接到pGEM-T載體上，并轉化至JM-109感受態細胞中，37℃培養過夜，挑取單個菌落，以上游引物和下游引物進行PCR篩選挑取陽性克隆。重組質粒采用質粒DNA提取試劑盒（OMEGA）提取。用紫外分光光度計定量后，用含10ng/mL鮭魚精DNA的1×TE（pH8.0）連續 10 倍稀釋至濃度在 1.0×100～1.0×109拷貝/μL之間，取5μL作為模板。

2 結果

2.1 熒光PCR鑒定艱難梭菌特異性評價 本研究根據艱難梭菌tcdB基因作為檢測的靶基因，設計的引物和熒光探針序列通過BLAST比對分析未發現與其同源序列，說明引物探針的特異性較好。通過與本實驗室保存的福氏志賀菌、空腸彎曲菌、產單核李斯特菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸埃希菌O157：H7、沙門菌和副溶血性弧菌同時進行熒光PCR檢測，結果表明僅有艱難梭菌出現陽性響應，其他無陽性信號，說明該方法特異性較好。

2.2 熒光PCR檢測艱難梭菌線性范圍分析 采用本研究建立的熒光PCR方法檢測上述系列稀釋的1.0×100～1.0×109拷貝/μL 的標準品，結果顯示，100～107拷貝/μL的8個梯度標準品均出現響應信號，而且CT值與拷貝數的對數具有較好的線性關系，說明本研究建立的方法能夠檢測1個拷貝的艱難梭菌，具有較高的靈敏度。

2.3 臨床糞便標本檢測 采用生物梅里埃公司的VIDAS方法對278份糞便標本進行檢測，結果顯示，艱難梭菌毒素陽性樣本18份；采用熒光PCR方法檢測顯示艱難梭菌陽性標本20份。兩種方法檢測艱難梭菌陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

艱難梭菌是引起醫源性腹瀉和抗生素相關性腹瀉的重要病原菌，一旦醫院感染暴發，芽胞的高抵抗力將使感染難以在短期內得到有效控制。因此，臨床快速診斷艱難梭菌極其重要。艱難梭菌主要分泌細胞毒素而致病，不含毒素基因的無毒菌株為非致病菌[6]。因此單純在糞便培養中分離出艱難梭菌的診斷意義不大，必須進行毒素的檢測。所以，國際公認的檢測“金標準”仍然是傳統的糞便標本培養和細胞毒素測定[7]。但細菌培養法不僅操作繁瑣耗時而且容易漏檢，不適合快速診斷。目前一些實驗室采用酶免疫方法檢測艱難梭菌，雖然該方法操作簡便快速，但其靈敏度不高并且存在交叉反應等問題[8]。PCR應用于臨床微生物領域最大的優點在于其能夠快速檢測病原體而達到快速診斷的目的[9]。本研究建立的定量檢測艱難梭菌的熒光PCR方法能夠從糞便中直接檢測分泌毒素的艱難梭菌，并且具有較好的特異性，而且能夠檢測1個拷貝的艱難梭菌，具有較高的靈敏度；本方法與生物梅里埃公司的VIDAS方法比較具有較高的一致性，因此本方法能夠應用于臨床檢測艱難梭菌感染，對快速診斷艱難梭菌感染，控制醫源性感染具有重要意義。

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［5］李永強，聶玉強，楊銀梅.臨床分離艱難梭菌的耐藥性分析［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2010，19（10）：922-925.

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