熊果酸聯合供者特異性淋巴細胞輸注誘導小鼠免疫耐受

劉勇 李堯 黃霞 李超 薛承彪 胡昕鵬 楊濤 周平

核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是 T 細胞活化重要信號分子。我們前期研究發現T細胞特異性 NF-κB 活化障礙小鼠——IκBαΔN-Tg 小鼠，能夠永久接受異基因心臟移植物。本研究將探討以NF-κB為干預靶點的小分子化合物——熊果酸對小鼠異基因心臟移植的影響。

實驗方法如下:(1)流式細胞術分選獲取C57BL/6(B6)脾臟T細胞并于體外培養。實驗分3組:對照組僅加入T細胞;單克隆抗體(簡稱單抗)刺激組同時加入2 μg/mL抗CD3單抗和1 μg/mL抗CD28單抗;單抗刺激+熊果酸組在加入單抗前將 T 細胞與5、10、25 μmol熊果酸各孵育2 h。單抗刺激24 h后檢測p65核轉位程度，48 h后檢測T細胞表面CD25、CD69表達以及培養上清液中IL-2水平。(2)建立BALB/c到B6或RAG-/-(T細胞和B細胞缺陷)的腹部心臟移植模型。分為5組:空白對照組僅行心臟移植;溶劑對照組使用0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;供者特異性淋巴細胞輸注(donor specific transfusion，DST)組在移植成功后立即給予DST(1.0×107BALB/c脾臟細胞，自眼球后輸入);熊果酸組自術前1 d至術后14 d每天給予20 mg/kg熊果酸灌胃;熊果酸聯合DST組采用前述兩種措施。(3)二次心臟移植。采用頸部心臟移植，受體為移植心臟長期存活小鼠(long time survival，LTS)，供體分別為BALB/c和C3H小鼠。(4)過繼輸注。1×107B6脾臟細胞、1×107LTS脾臟細胞、1×107B6脾臟細胞+1×107LTS脾臟細胞分別輸注給移植了BALB/c心臟的RAG-/-小鼠;1×107排斥了BALB/c移植心臟的B6小鼠(簡稱Rej)脾臟細胞輸注給移植了BALB/c心臟的RAG-/-小鼠和LTS。(5)術后觀察。每天捫診心臟，觀測移植心臟存活時間;檢測術后7 d LTS脾臟細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例;INF-γ酶聯免疫斑點法檢測各組細胞對不同抗原的反應性。

結果:(1)單抗刺激24 h后T細胞核內NF-κB p65 上升，而 5、10、25 μmol的熊果酸分別將其下調。48 h后25 μmol的熊果酸將單抗刺激后T細胞表面CD25下調92.4%，CD69下調89.3%;上清液中 IL-2 濃度上升，5、10、25 μmol的熊果酸分別將其下調。(2)移植心臟平均存活時間空白對照組與溶劑對照組相似，DST組延長，20 mg/kg熊果酸可將其延長至(36.8±0.6)d，熊果酸聯合 DST可使84.6%的移植心臟存活超過150 d。(3)二次心臟移植時，LTS可持續(＞100 d)不排斥BALB/c心臟，而在14 d內排斥C3H心臟。LTS脾臟細胞對C3H抗原反應正常，而對BALB/c抗原反應降低。術后7 d時脾臟中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例熊果酸聯合DST組與LTS相似。排斥反應發生時間聯合移植LTS和B6脾臟細胞與單純輸注B6脾臟細胞無明顯差異，LTS接受Rej脾臟細胞后與RAG-/-小鼠輸注Rej脾臟細胞后也無明顯差異。

綜上結果，熊果酸可劑量依賴性地抑制抗CD3、CD28單抗促發的T細胞NF-κB核轉位和T細胞活化。短期應用熊果酸輔以手術當天DST能誘導供者特異性小鼠移植心臟免疫耐受，而CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞作用及其他調節機制并非該耐受模型的主要機制。

相關研究 Ursolic acid promotes robust tolerance to cardiac allografts in mice由華中科技大學同濟醫院器官移植研究所周平(pzhou@tjh.tjmu.edu.cn)團隊完成，全文將發表于Clinical and Experimental Immunology 2011年第2期。