2011年美國骨髓移植會議臨床熱點薈萃

盛立霞 肖浩文 黃河

2011年2月17—21日美國骨髓移植會議(Bone Marrow Transplant Tandem Meeting)在美國夏威夷舉行，來自世界各地的4000余名造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)專家和代表參與，650余份論文交流，其中口頭報告100余份。大會主題涉及造血干細胞及移植免疫的基礎研究、HSCT后過繼細胞免疫治療、非清髓預處理在臍血及單倍體相合HSCT中的應用、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)對移植預后的影響以及異基因HSCT后復發的治療等。本文就部分臨床熱點內容作一簡介。

1 HSCT領域的基礎研究熱點

造血干細胞自我更新的機制和定向分化條件一直是干細胞研究的熱點。西班牙Himburg［1］研究小組發現來自微環境的多效蛋白(pleiotrophin，PTN)信號通路在造血干細胞的自我更新中有重要作用。在體外培養中使用肝素結合蛋白和PTN處理鼠和人的造血干細胞可以顯著誘導造血干細胞的自我更新。研究組使用PTN基因敲除(PTN-/-)小鼠發現其在產生總的骨髓細胞和骨髓克隆形成細胞方面沒有顯著的差異，但是CD34-c-kit+sca-1+lin-(簡稱34-KSL)細胞的數量明顯減少，同時集落形成單位減少了2倍以上，而PTN-/-小鼠長期重建造血干細胞的比例下降11倍。將同基因小鼠骨髓分別移植給PTN-/-或PTN+/+小鼠形成嵌合體，PTN-/-小鼠中骨髓34-KSL及脾集落形成單位數量較PTN+/+明顯減少，進一步證實骨髓微環境中PTN的表達對造血干細胞是必須的。實時定量PCR檢查發現在野生型小鼠中無論骨髓成骨細胞還是內皮細胞均表達PTN。在非接觸培養體系中共同培養骨髓內皮細胞和骨髓，加入抗PTN抗體能明顯阻斷骨髓內皮細胞的支持。這些研究表明PTN由在骨髓龕位中的內皮細胞分泌，并且PTN信號對于維持體內骨髓造血干細胞池是必要的。

在HSCT后，無論造血干細胞或者同種異體反應性T細胞均快速增殖，增殖活躍的細胞通過氧化磷酸化作用或者糖酵解增加腺苷三磷酸以獲得足夠的能量。佛羅里達大學Wahl［2］研究小組在小鼠移植模型中發現造血干細胞與同種異體反應性T細胞在快速增殖過程中的能量代謝途徑的差異。在同基因移植的小鼠模型中(B6移植至B6-Ly5.2)，增殖中的造血干細胞及祖細胞糖酵解活性增高3倍，而氧化磷酸化則沒有改變。而與此不同的是，在B6移植至B6D2F1的移植物抗宿主病(graft-versushost disease，GVHD)模型中，同種異體反應性T細胞中的氧化磷酸化表達較未受激的T細胞表達增高2倍以上，可提供80% ～90%的腺苷三磷酸供能。T細胞更快的增殖速度及氧化磷酸化的活性增高可能與增加的氧化應激反應有關，細胞內活性氧增加，而抗氧化劑減少。骨髓細胞的增殖并沒有表現出這個異常的生理學代謝過程。為此研究組使用一種新型的苯二氮卓類藥物Bz-423來模擬這一異常的氧化還原過程。單劑量的Bz-423可以使得同種異體反應性T細胞細胞內活性氧增加2倍以上，凋亡增加了50%。而該藥物在未激活的T細胞、B細胞及增殖的造血干細胞中沒有增加細胞內活性氧或者誘導凋亡的效果。6個劑量的Bz-423在重度GVHD模型中明顯降低小鼠死亡率，同時減輕了肝和腸道中GVHD相關的病理學改變，并且Bz-423的治療并沒有造成免疫重建延遲或者植入失敗。但Bz-423和caspase泛抑制劑一起使用時生存優勢完全喪失，由此推測Bz-423的療效主要是減少凋亡。該研究發現了同種異體反應性T細胞特有的異常的代謝途徑，這個途徑以增加氧化磷酸化及消耗抗氧化劑為特征，這一有別于正常造血干細胞的特點有望成為抗GVHD藥物的新靶點。

基因靶向治療在人類遺傳性出血性疾病的治療方面具有潛在的應用前景。Du［3］研究小組報道通過基因工程獲得產凝血因子Ⅷ的血小板可以用來治療犬類血友病。他們采用犬粒細胞集落刺激因子/干細胞因子動員出犬的外周造血干細胞，進而分選CD34+細胞，通過慢病毒轉導入相關基因，包括血小板特異性整合素aⅡb基因的啟動子及人的凝血因子Ⅷ基因。所有的實驗動物均表現出血友病A臨床癥狀改善，凝血時間明顯縮短。這些研究結果為人類遺傳性出血性疾病的治療提供了一條新的途徑。

2 過繼細胞免疫治療的療效及安全性

異基因HSCT后免疫重建延遲將導致病毒感染發生率增高。EB病毒、CMV和腺病毒是HSCT后最常感染的致病性病毒，采用這些病毒特異性的細胞毒T淋巴細胞過繼治療有望在移植早期恢復機體的病毒免疫力，提高移植療效。然而，制備特異性產品需要花費較長時間，這限制了其應用。Leen［4］研究小組探討通過輸注HLA部分相合的異基因細胞毒T淋巴細胞治療耐藥的病毒感染的可行性、安全性和有效性。該研究小組采用美國心肺血液研究所細胞治療援助計劃產品，生產并檢測了30多個多病毒特異性的多克隆T細胞系，抗病毒特異性針對CMV、EB病毒和腺病毒。至目前共篩查53例患者，49例可以鑒定出可能合適的多克隆細胞系，其中29例接受1～3個HLA位點相合的1～3種細胞系的輸注(原發病包括難治性EB病毒相關的移植后淋巴細胞增生性疾病6例、持續CMV感染13例、持續腺病毒感染9例、CMV和腺病毒同時感染1例)。治療后2例之前有皮膚急性GVHD及慢性GVHD的患者病情活動，2例出現短暫的皮疹，2例發生血栓性微血管病(患者有西羅莫司治療史等其他危險因素)。26例患者在治療后42 d完全緩解和部分緩解率為84.6%，其中CMV感染92.3%、EB病毒感染80%、腺病毒感染75%。令人振奮的是其中16例患者獲得完全病毒免疫力，包括采用只有1個HLA位點相合的細胞系治療的患者。這些結果表明采用庫存細胞毒T淋巴細胞系對異基因HSCT受者進行抗病毒治療是一個切實可行的治療策略。

目前很多研究報道EB病毒和CMV特異性T細胞具有異源HLA反應性，這些病毒特異性的T細胞輸注到HLA部分相合的受者體內時，可能會導致GVHD。Melenhorst［5］小組的研究卻證實異基因病毒特異性T細胞雖然具有HLA異源反應性，但是并不會導致GVHD。他們選取153對異基因HSCT供、受者，包括73對HLA部分相合者，將供者來源的病毒特異性T細胞輸注給受者。輸注細胞毒T淋巴細胞后，無新發的GVHD，原有GVHD的復發率為6.5%，與HLA是否相合無顯著關系。隨后，他們采用已知不表達CMV和EB病毒抗原的活化T細胞作為抗原呈遞細胞，分析4個供者來源的雙病毒特異性T細胞系的HLA異源反應性。在體外研究中發現病毒特異性細胞毒T淋巴細胞與受者抗原呈遞細胞具有HLA異源反應性，但是與GVHD的發生無相關性，因此患者接受經典的HLAⅠ類和(或)Ⅱ類基因不相合的供者病毒特異性細胞毒T淋巴細胞輸注是安全的。

3 非清髓預處理在臍血移植及單倍體相合移植中的應用

在找不到HLA相合同胞供者的情況下，臍血和親緣HLA單倍體相合供者也是目前廣泛采用的造血干細胞來源。本次大會報告了血液骨髓移植臨床試驗網開展的非清髓性預處理在這兩類移植中的臨床試驗結果［6］。“無關供者雙份臍血非清髓移植治療血液系統惡性腫瘤的Ⅱ期臨床試驗”前瞻性評估在預后差的白血病及淋巴瘤患者中進行雙份臍血非清髓移植的療效。入選患者年齡小于70歲，器官功能及體能狀況能夠耐受移植。預處理方案:氟達拉濱40 mg/m2靜脈滴注-6～-2 d(以移植當天為0 d，移植前為負數，移植后為正數表示時間)，環磷酰胺50 mg/kg靜脈滴注-6 d，全身照射200 cGy-1 d。免疫抑制采用鈣調磷酸酶抑制劑聯合嗎替麥考酚酯，粒細胞集落刺激因子從+1 d開始。所有患者接受HLA 4～6個位點相合的雙份臍血。16個中心共有54例入組，中位年齡58(16～69)歲，其中4例退出試驗。50例可評估患者的中位隨訪時間364(154～381)d。6個月總體存活率72%(95%CI 56% ～83%)，疾病無進展存活率 63%(95%CI 48% ～76%)。180 d累積治療相關死亡率20%(95%CI 8% ～31%)，復發或進展率 4%(95%CI 4% ～24%)。18例死亡，復發或進展是主要死因。56 d累積Ⅱ～Ⅳ級急性 GVHD發生率36%(95%CI 22% ～50%)，Ⅲ ～ Ⅳ級急性 GVHD發生率10%(95%CI 2% ～19%)，180 d慢性GVHD累積發生率13%(95%CI 3% ～24%)。56 d中性粒細胞恢復的累積發生率為94.0%(95%CI 87% ～100%)，中位恢復時間17(6～45)d。3例發生原發性植入失敗，1例繼發性植入失敗。這些數據說明非清髓雙份臍血移植是安全的，可為設計備選供者非清髓移植治療血液系統惡性腫瘤的臨床試驗構建基礎。

一項Ⅱ期臨床試驗評估在預后差的急性白血病及淋巴瘤患者中進行非清髓單倍體相合骨髓移植以及移植后大劑量環磷酰胺預防GVHD的療效［7］。入組患者來自17個中心，有52例實行了移植，中位年齡51(7～70)歲。預處理方案:環磷酰胺14.5 mg/kg靜脈滴注-6 d和-5 d，氟達拉濱30 mg/m2靜脈滴注-6～-2 d，全身照射200 cGy-1 d，并輸注富含T淋巴細胞的骨髓。預防GVHD的方案包括環磷酰胺50 mg/kg靜脈滴注+13～+14 d，嗎替麥考酚酯+15～+135 d，他克莫司+15～+1180 d。非格司亭從第15天開始用至中性粒細胞數恢復。結果，100%T淋巴細胞嵌合，1例出現原發性植入失敗，無繼發性植入失敗。156 dⅡ級急性GVHD累積發生率31%(95%CI 18% ～44%)，1180 d慢性GVHD累積發生率11%(95%CI 1% ～22%)，無一例發生Ⅲ～Ⅳ級急性GVHD。1180 d復發或進展發生率和非復發死亡率分別是19%(95%CI 7%～32%)和5%(95%CI 0～13%)。10例出現復發或進展，13例死亡(疾病復發或進展8例、感染2例、植入失敗1例)。存活受者的中位隨訪時間為294(76～650)d，6個月總體存活率和無事件存活率分別是82%(95%CI 65% ～91%)和75%(95%CI 59% ～86%)。該研究證明非清髓HLA單倍體相合骨髓移植是安全可行的。

4 HSCT后復發的治療及預后評估

基礎疾病復發成為異基因HSCT治療急性白血病失敗的主要原因。異基因HSCT后復發的急性髓細胞白血病或骨髓異常綜合征患者的預后很差。Schroeder［8］等開展了一項前瞻性的多中心Ⅱ期臨床試驗，評估阿扎胞苷聯合供者淋巴細胞輸注作為異基因HSCT后復發的急性髓細胞白血病或骨髓異常綜合征患者一線治療的可行性。患者接受最多8個療程的阿扎胞苷治療 (100 mg·m-2·d-1，1～5 d，每28 d 1個療程)，每兩個阿扎胞苷療程后給予劑量遞增的供者淋巴細胞輸注［(1～5)×106～(1～5)×108細胞/kg)］共3次。目前可評估患者25例，其中急性髓細胞白血病患者23例(92%，新發15例、從骨髓異常綜合征進展而來8例)，骨髓異常綜合征患者1例(4%)，骨髓異常綜合征/骨髓增殖綜合征1例(4%)。所有患者接受中位數為3(1～8)個周期的阿扎胞苷治療，18例(72%)接受1～4次供者淋巴細胞輸注(中位CD3+細胞劑量5×106/kg，范圍1×106～207×106)。總體反應率為64%，其中5例(20%)獲得完全緩解，3例(12%)獲得部分緩解，8例(32%)病情穩定，中位反應維持時間266 d。6例(24%)出現急性GVHD(皮膚2例、肝6例、腸道2例)，中位發生時間為第1次供者淋巴細胞輸注后的65(19～179)d，3例(12%)出現局限性慢性GVHD。Ⅲ～Ⅳ度血液學毒性發生率為64%，常見的不良事件是胃腸道副作用以及感染。中位隨訪時間100(25～485)d，15例(60%)存活，受者中位存活時間為184(87～281)d。所有獲得完全緩解的患者繼續保持緩解狀態的中位時間229 d。采用阿扎胞苷聯合供者淋巴細胞輸注作為異基因HSCT后復發的急性髓細胞白血病或骨髓異常綜合征患者的拯救性治療具有顯著的抗白血病作用。

美國血液學協會發布的基于循證醫學的最新指南對移植后復發受者進行二次移植的推薦類別為1B，然而哪些患者會從二次移植中獲益尚不確定。Rezvani［9］等報告采用歐洲骨髓移植組(European Bone Marrow Transplant Group，EBMT)建立的用于慢性粒細胞白血病的危險評分系統預測二次異基因HSCT患者預后的價值。他們分析了1985年10月—2010年2月采用異基因供者干細胞進行二次移植的124例受者的預后因素。第1次移植干細胞來源于自體的患者64例、異基因的患者60例。患者年齡、疾病分期、從發病到移植的時間、供者類型、供受者性別組合被納入評分系統(0～7分)，根據評分分為高、中、低危3組。多變量分析發現高死亡率與兩個重要因素相關:危險度評分(高危組與低危組RR=2.89，P≤0.001)和兩次移植的時間間隔(大于 20個月組與小于20個月組 RR=1.55，P ＜0.05)。EBMT評分采納的5個移植前患者及供者特征能夠對二次移植效果進行很好的風險預測，結合兩次移植時間間隔和EBMT評分能夠更加精確地預測預后，有助于選擇從二次移植中最可能獲益的患者。

5 活化型KIR對HSCT預后的影響

既往的研究多集中在抑制性KIR對移植預后的影響，近年來，活化型KIR對異基因HSCT預后的影響也逐漸引起關注。Venstrom［10］研究小組報告了端粒端KIR2DS1和KIR3DS1基因，以及著絲粒端KIR2DS2基因對進行非親緣異基因HSCT后的預后影響。回顧性分析1989—2008年間進行HLA(9～10)/10位點相合的非親緣異基因HSCT的急性髓細胞白血病患者1228例。應用Cox回歸分析法分析供者KIR基因型與移植效果的相關性。422名供者為 KIR2DS1陽性，429名供者為KIR3DS1陽性(其中355名供者KIR2DS1和KIR3DS1同時陽性)，630名供者為KIR2DS2陽性。供者KIR2DS1基因與較低的疾病復發有關［HR=0.76(0.61～0.96)，P=0.02］，根據共表達 KIR2DS2和 KIR3DS1情況分別進行校正后這一相關性依然存在。供者的KIR3DS1基因型與降低非復發死亡率［HR=0.68(0.50～0.92)，P=0.01］和總體死亡率［HR=0.79(0.63 ～0.98)，P=0.03］相關。供者 KIR2DS2 基因與移植后存活率、復發率和非復發死亡率無顯著相關性。活化型KIR基因的個體差異性可能對急性髓細胞白血病患者進行非親緣異基因HSCT的效果有不同的影響，KIR2DS1防止疾病復發，而KIR3DS1可以減少非復發死亡率。

中國蘇州的Wei［11］等也報道了活化型KIR基因對HLA相合親緣HSCT預后的影響。他們采用序列特異性引物PCR技術檢測進行HLA全相合同胞供者HSCT的40對供受者的KIR基因型，回顧性分析這些患者的預后。在40對供受者中KIR2DS4、KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DS5、KIR2DS2 和 KIR2DS3基因的出現頻率分別是95%、40%、36.25%、31.25%、21.25%和20%。KIR2DS4*001/002和 KIR2DS4*003-007純合子概率分別是55.9%和8.8%，而KIR2DS4*001/002和KIR2DS4*003-007雜合子概率是35.3%。供者無KIR2DS2基因移植后疾病復發率為19.2%，而供者具有KIR2DS2基因疾病復發率為0。KIR單體型為A/A的供者，如果供者具有KIR2DS4*003-007雜合子，移植后的1年無病存活率是70%，供者為KIR2DS4*001/002純合子基因型，則移植后1年無病存活率是87.5%。如果供者具有3個及以上活化型KIR基因，1年無病存活率是72.2%;如果供者只有1～2個活化型KIR基因，1年無病存活率為81.8%。在HLA相合同胞供者的HSCT中，活化型KIR基因表達的數目及亞型可能與低疾病復發以及改善HLA相合同胞移植的預后相關。

6 HSCT供受者病毒感染的臨床特征及預后

CMV和HBV在中國人群中是常見的感染病原體，在移植前供者及受者體內可能是隱性感染或者攜帶狀態，HSCT后宿主的免疫抑制狀態增加了病毒再激活的機會。浙江大學醫學院附屬第一醫院骨髓移植中心“HSCT后早期CMV感染風險與T淋巴細胞協同刺激分子的基因多態性有關”的論文是大會口頭報告論文之一［12］。該研究檢測了116對無關供者HSCT及87對HLA相合HSCT中供受者的5種單核苷酸多態性:CD28-594(A/G)、ICOS-693(G/A)、CTLA-4-1722(A/G)、149(A/G)和 CT60(A/G)，并分析這些單核苷酸多態性與 HSCT后100 d內CMV感染的關系。結果發現，除1名來自臺灣的供者外，所有患者和供者均為CMV血清學IgG陽性。117例患者(57.6%)在HSCT后早期出現CMV感染，發生感染的中位時間為26(2～64)d。其中23%發生在粒細胞缺乏期，77%在粒細胞恢復以后。92.3%患者為無癥狀的CMV抗原陽性，僅有9例患者發生CMV相關疾病(CMV肺炎7例和CMV腸炎2例)。在無關供者和親緣供者的HSCT中，當供者基因型為CTLA-4 CT60 AA時，受者發生移植后早期CMV感染的概率比供者基因型為AG/GG的受者高。通過多變量分析確定了4個早期CMV感染的危險因素:患者HSCT前的CMV再激活、無關供者移植、患者發生急性GVHD以及供者為CTLA-4 CT60 AA基因型。提示抗病毒預防性治療及搶先治療有效，首次發現T淋巴細胞協同刺激分子的基因多態性與早期CMV感染具有相關性。

中國是HBV感染的高發區，闡明HBV感染對異基因HSCT的影響及進一步明確有效的防治措施十分必要。浙江大學醫學院附屬第一醫院骨髓移植中心回顧性分析了供者為HBV血清學陰性、受者為HBV感染的無關供者 HSCT后效果［13］。1998—2009年5月間共有222例患者進行了無關供者HSCT。移植前HBsAg陽性組17例，均接受了拉米夫定或恩替卡韋治療;移植后該組中1例患者發生了病毒再激活，8例患者HBsAg轉為陰性并出現了HBsAb。154例移植前HBsAg和HBcAb均陰性患者移植后均未出現HBsAg陽性。51例移植前HB-sAg陰性而HBcAb陽性患者中2例發生了病毒性肝炎，1例經拉米夫定治療后病情改善，還有1例死于HBV相關的肝功能衰竭。總體存活率和急性GVHD、慢性GVHD發生率在3組中差異均無統計學意義。提示受者HBV感染經積極的抗病毒預防和治療并不影響異基因HSCT預后，受者HBV感染不是移植的禁忌證。

1 Himburg HA，Daher P，Russell L，et al.Pleiotrophin signaling is necessary for hematopoietic stem cell self renewal and is regulated by the bone marrow microenvironment［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149.

2 Wahl DR，Gatza E，Opipari AW，et al.Manipulation of the bioenergetics of alloreactive T cells leads to their selective apoptosis and arrests graft versus host disease［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149.

3 Du LM，Franck HWG，Merricks EP，et al.Gene therapy targeting synthesis of coagulation factorⅧin platelets reduces bleeding in canine hemophilia A［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149-S150.

4 Leen AM，Bollard CM，Mendizabal A，et al.Most closely HLA-matched allogeneic virus specific cytotoxic T-lymphocytes(CTL)to treat persistent reactivation or infection with adenovirus，CMV and EBV after hemopoietic stem cell transplantation(HSCT)［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151-S152.

5 Melenhorst JJ，Leen AM，Bollard CM，et al.Allogeneic virus-specific T cells with HLA alloreactivity do not produce graft-versus-host disease in human subjects［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S158.

6 Brunstein CG，Carter S，Fuchs EJ，et al.PhaseⅡtrial of non-myeloablative conditioning(NST)double umbilical cord blood transplantation(DUCBT)from unrelated donors in patients with hematologic malignancies:results of blood and marrow transplant clinical trials network(BMT CTN)protocol 0604［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151.

7 Fuchs EJ，Wu J，Carter S，et al.PhaseⅡtrial of non-myeloablative conditioning and partially HLA-mismatched(HLA-haploidentical)bone marrow transplantation(BMT)for patients with hematologic malignancies:results of blood and marrow transplant clinical trials network(BMT CTN)protocol 0603［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151.

8 Schroeder T，Czibere AG，Kr?ger N，et al.Combining azacitidine(vidaza?，aza)and donor lymphocyte infusions(DLI)as first salvage treatment in patients(PTS)with acute myeloid leukemia(AML)or myelodysplastic syndromes(MDS)relapsing after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-SCT):interim-analysis from the azarela-trial(NCT-00795548)［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S159.

9 Rezvani K，Marin D，Goldman JM，et al.Risk score predicts outcome of second allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S155.

10 Venstrom JM，Pittari G，Chewning J，et al.Donor KIR2DS1 and KIR3DS1 are associated with improved outcomes following unrelated allogeneic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S156.

11 Wei X，Feng Y，Sun A，et al.Impact of the distribution and the effect of kirs and activating KIR on outcome of HLA-identical sibling hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S295-S296.

12 Xiao H，Luo Y，Shi J，et al.T-cell costimulatory molecule genotypes are associated with the risk of early cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S156.

13 Luo Y，Hu Y，Tan Y，et al.Virologic and clinical outcomes of hepatitis B virus infection in recipients undergoing unrelated-donor hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S303.