乳白蛋白-油酸復合物抗癌活性研究進展

文 / 方 冰 郭慧媛 張 昊 任發政 中國農業大學教育部功能乳品重點實驗室

1995年，Hakansson等人在研究母乳抗菌活性時意外發現，母乳中含有一種特異性誘導腫瘤細胞凋亡的物質，并且其分子量同乳白蛋白很相近，但單純的乳白蛋白并不能引起腫瘤細胞的凋亡，故稱這種誘導細胞凋亡的物質為乳白蛋白聚合物[1]。隨后的幾年，Svensson及Svanborg等人對這種聚合物的組成和結構進行了深入的研究，確定這種聚合物為乳白蛋白－油酸復合物（Human Alpha-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells，HAMLET），并于2000年成功地在體外合成了這種誘導腫瘤細胞凋亡的物質[2]。近年來，針對HAMLET的研究已成為食品、醫學以及分子生物學領域中的一個熱點。本文將從HAMLET的結構、活性、作用途徑及臨床應用4 個方面展開論述。

1 HAMLET的結構

Α－乳白蛋白主要存在于哺乳動物的乳汁中，由122或123 個氨基酸組成，包含2 個結構域，即較大的α－折疊結構域和較小的β－折疊結構域。這2 個結構域由Ca2+和4 條二硫鍵穩定連接[3]。

乳白蛋白（Lactalbumin，LA）本身并沒有誘導腫瘤細胞凋亡的活性，必須同油酸結合后才能具備凋亡活性。通過核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、透射電鏡及原子力顯微鏡觀察HAMLET結構時發現，油酸不是單純的與蛋白質的氨基酸側鏈結合，而是被蛋白質包裹而形成膠囊狀復合物[4]。LA的折疊核心位點在包含Ca2+結合位點的α－區域和β-區域的界面上[5]。由此可推測，油酸的結合區域很可能是在Ca2+結合區域。油酸的結合使得LA的結構發生了改變并在一定程度上穩定了HAMLET的構象。圓二色譜測定LA及HAMLET的二級結構時也發現，HAMLET中的α－螺旋結構要明顯多于LA中的[5]。氨基酸末端序列測定及氫/氘離子交換NMR研究表明，油酸是通過與脫去Ca2+后伸展開的β-折疊區域結合，進而轉化為α－螺旋[6]。

2003年，Svensson等人研究了不同碳鏈長度、不同飽和度、不同雙鍵構型的16 種脂肪酸同LA結合形成HAMLET的能力[7]。結果表明，LA只能同油酸及其他十八碳飽和脂肪酸（如硬脂酸）、不飽和脂肪酸（如亞油酸）形成具有凋亡活性的復合物，其他較短碳鏈的飽和及不飽和脂肪酸、反式脂肪酸（包括十八碳）均不能同LA結合，表明脂肪酸同部分伸展的LA形成了特定的構型，從而使得這些復合物能夠特異性殺死腫瘤細胞。

2 HAMLET的促腫瘤細胞凋亡活性

2.1 體外活性

在Hakansson等人首次發現乳白蛋白復合物能夠促進肺癌細胞A549的凋亡之后，人們又研究了HAMLET對其他細胞的凋亡活性。迄今為止，已測定了來源于肺、喉、腎、結腸、膀胱、前列腺、卵巢、皮膚、淋巴等40 余種腫瘤細胞對HAMLET的敏感性[1，8]。所有檢測結果皆表明，腫瘤細胞在HAMLET處理后發生了凋亡，尤其是淋巴類腫瘤細胞，對HAMLET的敏感性要高于其他實體瘤細胞。

2.2 體內活性

HAMLET在體外取得了良好的效果后，研究者開始關注HAMLET在體內的抗腫瘤活性。2004年，Fischer等人將人多形性膠質母細胞瘤細胞懸液注射到裸鼠大腦中，對造模成功的老鼠顱腔灌注HAMLET，并以LA作為對照。實驗發現，注射LA的老鼠在8 周后出現顱腔壓力升高等癥狀，而注射HAMLET的老鼠卻無相應癥狀。NMR掃描腦部組織發現，對人神經膠質瘤模型鼠的腦腔灌注HAMLET可以顯著減小腦瘤體積，并延長老鼠的生存時間，而LA卻無此作用。同時對腫瘤組織進行凋亡檢測發現，HAMLET可以誘導腦腫瘤細胞凋亡，而對周圍健康腦細胞則無影響[9]。2009年，Mossberg等人對小鼠膀胱注射人膀胱癌細胞，造模成功后對膀胱組織灌注HAMLET和LA進行治療。結果表明，灌注HAMLET組小鼠膀胱腫瘤體積明顯縮小，凋亡檢測也呈陽性結果。同時，該研究中將HAMLET和LA進行熒光標記，通過全身熒光檢測發現，HAMLET僅分布于膀胱癌組織中，在腫瘤組織周圍的正常組織中并無分布[10]。

3 HAMLET的作用途徑

3.1 穿透細胞膜

HAMLET處理腫瘤細胞后會結合到細胞的表面并迅速進入細胞內，而LA及油酸本身均不具有進入細胞的能力。有學者利用熒光標記的HAMLET和LA處理小鼠淋巴癌細胞L1210，發現HAMLET和LA都可以吸附在細胞表面，但HAMLET卻能夠大量地進入L1210的細胞內[1]。熒光及NMR分析結果表明，乳白蛋白的α－螺旋保護了HAMLET中的抗腫瘤功能區[11]。腫瘤細胞豐富的細胞膜磷脂或存在于細胞膜外層的O型糖基化粘液素可能是HAMLET能高效結合腫瘤細胞膜并侵入腫瘤細胞的重要原因。

3.2 改變線粒體的形態功能

3.3 激活胞內蛋白酶

HAMLET除作用于腫瘤細胞的線粒體和細胞核外，還作用于細胞內的蛋白酶和泛素化蛋白酶體系統。侵入腫瘤細胞中的HAMLET可以同20S蛋白酶體結合，改變蛋白酶體的結構，從而激活細胞內蛋白酶而降解大量的細胞內蛋白質，即使隨后去除進入細胞的HAMLET，蛋白酶仍能降解細胞內的蛋白質[13]。同時，用蛋白酶體類的酶，如胃蛋白酶、糜蛋白酶體以及細胞內提取的20S蛋白酶體作用于HAMLET和LA時發現，HAMLET耐蛋白酶酶解的能力遠高于LA。由此可知，HAMLET這種穩定的構象同其活性密切相關。

3.4 結合細胞核內染色質

以半數致死量的HAMLET培養腫瘤細胞1 h，90%的HAMLET定位于細胞核內。入核的HAMLET以高親和力結合組蛋白H3，以較低親和力結合組蛋白H4和H2，破壞組蛋白在DNA上的沉積，最終以高親和力結合染色質，使腫瘤細胞染色質形成非水溶性復合物，從而致基因轉錄停止，誘導細胞死亡[14，15]。故常在HAMLET處理死亡的腫瘤細胞內可以檢測到DNA片段及與DNA損傷相關的Caspase－2[16]。

4 臨床應用

HAMELT在臨床治療上的應用目前已在皮膚乳頭狀瘤及膀胱癌2 個方面得到驗證。2003年，Gustafsson等人對40例皮膚乳頭狀瘤患者進行了HAMLET的治療研究[17]，以安慰劑作為對照，給藥3 周，1 個月后觀察治療結果。實驗發現，HAMLET治療組的患者1 個月后皮膚乳頭狀瘤體積平均縮小75%，而安慰劑組患者僅縮小15%～20%。于是，對之前給安慰劑的患者同樣采用HAMLET治療，1 個月后皮膚乳頭狀瘤體積縮小82%。同時，對所有接受過HAMLET治療的患者進行為期2年的觀察發現，這些患者的腫瘤并未復發，且未出現其他副作用。在后來膀胱癌的HAMLET治療研究中[18]，對9 例患表淺性膀胱癌的患者每天進行5 次患處HAMLET滴注，給藥10 天后對患者的膀胱組織進行內鏡檢查，發現有8 名患者的膀胱癌組織體積減小，膀胱癌細胞脫落。對病人體內殘留的癌組織進行凋亡檢測發現，這些組織的細胞都呈現出明顯的凋亡特征，同時，也在尿液中檢測出凋亡的膀胱癌細胞，而癌旁組織中的正常細胞未呈現任何凋亡特征。

5 結語

HAMLET是乳白蛋白同油酸結合的復合物，能特異性地進入腫瘤細胞，同時作用于線粒體、蛋白酶體和細胞核，誘導腫瘤細胞的凋亡。目前對HAMLET的形成、結構及活性機理已有較全面的了解，HAMLET類似物的制備方法及活性也正在研究中，這將為臨床治療腫瘤提供新的途徑。■

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