大腸癌分子生物學特征—轉化醫學與臨床應用研究

韓英 盛劍秋

北京軍區總醫院消化內科

大腸癌分子生物學技術及其轉化應用研究在 CRC篩查和診斷方面具有重要臨床意義。

1 大腸癌分子路徑

大腸癌分子路徑主要有三種：（1）染色體不穩定(CIN)路徑：占全部散發性CRC病例的70%～85%以上；（2）CpG 島甲基化表型 (CIMP) 路徑：導致散發性CRC的另一條主要路徑，包括高度MSI不穩定(MSI)所致的散發性CRC；（3）純微衛星不穩定（MSI）路徑：由于DNA錯配修復 (MMR) 基因胚（種）系突變，例如遺傳性非息肉病性大腸癌 (HNPCC) 。

參與CIN路徑的基因異常包括：APC基因，KRAS基因突；TP53基因。APC或β-catenin基因突變頻率，在腺瘤早期高達80%。APC基因突變的發現率，結腸癌約為60%，直腸癌約為82%。TP53 基因是腺瘤演變為腺癌的傳統路徑中的晚期事件；SMAD4蛋白胚系突變會導致幼年性息肉病綜合征，此病和CRC有關。在CIN路徑導致的CRC中，完全具備全部上述分子生物學異常者只占極少數。

MSI是一種重要的基因組不穩定路徑。在腫瘤和胚系細胞DNA的微衛星區域內，核苷酸重復序列復制錯誤，因而造成不穩定性。復制這些短的重復序列時，DNA聚合酶非常容易出錯，此種錯配修復（MMR）功能障礙導致了MSI。MMR系統組成至少有7種蛋白，MLH1基因、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，7種蛋白間特異性結合，形成功能性異二聚體（heterodimers）。MLH1和MSH2在錯配修復機制中是不可或缺的，具有五種功能性異二聚體蛋白（heterodimeric proteins）（MSH2-MSH3，MSH2-MSH6，MLH1-PMS1，MLH1-PMS2，MLH1-MLH3）。

HNPCC與MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的基因突變有關。檢測兩種單核苷酸（BAT25和Bat26）和三種二核苷酸（D5S346、D2S123和D17S250）。MSI-高度不穩定（MSI-H）：上述5個檢測位點中，MSI≥2（40%）；MSI-低度不穩定（MSI-L）：只有一個檢測位點陽性；微衛星穩定（MSS）：5個檢測位點均未發現不穩定性。

CIMP路徑是散發性CRC的另一常見路徑，約占散發性CRC的15%。CIMP路徑中啟動子區的甲基化異常，關鍵的抑癌基因（如MLH1）表達失活，導致表觀遺傳不穩定性，是散發性CRC的重要機制。CIMP陽性：3個以上的基因啟動子位點PMR≥10。CIMP陽性與BRAF基因突變密切相關；可分為兩型：CIMP-高（或CIMP1）：與BRAF基因突變相關，CIMP-低（或CIMP2），與KRAS基因突變相關，其病理學癌前病變的特征為絨毛腺瘤；細化分型的目的是為了深入探討癌變機制。CIMP陽性CRC具有明確臨床及病理特征：腫瘤好發于近端結腸，多見于中老年女性（最終的表型取決于是否伴發因基因啟動子甲基化導致MLH1轉錄沉默所誘導的微衛星不穩定性）。CIMP陽性+非MSI-H表型CRC病理的浸潤進展更嚴重，臨床預后及轉歸較差；病理組織中缺乏腫瘤浸潤淋巴細胞；CIMP路徑的癌前病變主要是無蒂鋸齒狀腺瘤。典型的CIMP陽性+MSI-H CRC 與純MSI-H CRC的特征相似，預后較好。腺瘤性息肉（從單純腺瘤發展為進展期腺瘤，最終形成浸潤性腺癌）是CIN路徑CRC以及HNPCC的癌前病變。鋸齒狀息肉（也是很重要的一種息肉）是CIMP路徑CRC的癌前病變 。

已經建立了家族性CRC綜合征從實驗室到臨床（bench to bedside）的診斷方法，是大腸腫瘤轉化醫學研究的最前沿水平。家族性CRC綜合征研究成果有助于深化對CRC的認識。

2 大腸癌分子生物學檢測對臨床診療的指導

大腸癌分子生物學檢測對臨床診療的指導包括以下幾個方面：

（1）FAP是常染色體顯性遺傳綜合征。APC基因胚系基因突變（APC是CIN路徑中的重要基因）。特征是大腸腺瘤數目＞100個。如果沒有手術干預，所有FAP病例均于50歲前發展為CRC。

（2）APC基因突變位點影響疾病的表型（無論是病變嚴重程度抑或相關的腸外特征都會受到影響）。APC基因中心區發生突變，大腸腺瘤數目較多，為典型FAP；

突變發生在基因兩端的3（或5）時，導致一種較為溫和的表型即所謂的衰減型FAP（AFAP），其特點是大腸腺瘤數目＜100個，CRC發生發展緩慢，比典型FAP延遲大約15年。

（3）MUTYH。MUTYH是一種DNA糖基化酶，幫助修復由于DNA氧化損傷導致的堿基錯配防止基因突變（例如APC和KRAS），在CIN路徑CRC發生發展過程中發揮關鍵作用。DNA修復缺陷是MAP的病因；MAP是一種常染色體隱性遺傳疾病，導致多發性大腸腺瘤和癌癥。MAP在表型上和AFAP相似。MUTYH雙等位基因突變導致CRC風險增加93倍。

（4）MAP臨床遺傳學檢測、篩查及咨詢。應對下列對象進行APC和MUTYH基因胚系突變檢測、篩查及臨床遺傳學咨詢：大腸腺瘤＞20個（包括異時性病變）；發病年齡＜60歲、腺瘤數目＞/ = 5，本人或一、二級親屬中60歲前患CRC或高級別異型增生腺瘤者。檢測程序通常會根據家族史而定。 已經確定的臨床病理標準可用于判定HNPCC“高危”患者及親屬；“高危”者應接受進一步的分子生物學檢測：MSI分析以及免疫組化法檢測與HNPCC相關的四個MMR蛋白質，即MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。如果MSI-H或腫瘤組織中選擇性表達蛋白質缺失，則先證者需要接受胚系基因檢測。HNPCC與 BRAF基因突變無關。BRAF檢測具有新的意義：BRAF陽性可以確定為CIMP路徑散發性CRC，從而排除HNPCC；臨床上，MSI-H+BRAF陽性CRC有助于判定其源于CIMP路徑MLH1基因甲基化，而不是HNPCC。

3 我們的研究工作

目前，我們已建立起以北京為中心，輻射北方地區的HNPCC協作組，共收集約200余個HNPCC家系。資料包括：患者腫瘤組織切片、患者及家系成員外周血樣本、提取的DNA、RNA以及相關臨床資料。建立了HNPCC MMR基因檢測綜合研究平臺。包括免疫組化檢測蛋白表達、微衛星不穩定性檢測、突變檢測、基因測序、大片段缺失和啟動子甲基化檢測等技術。利用該平臺對106個中國北方地區HNPCC家系進行了系統研究，43個家系中發現了致病性突變。

在14個FAP家系先證者中發現9例微小突變，突變檢出率為64.3%。包括6個移碼突變，2個剪接區突變和1個無義突變。發現4個新的APC基因微小突變。在微小突變檢測陰性的5例患者中，用MLPA的方法檢測出2例存在大片段缺失，這兩種大片段缺失均未見報道，大片段缺失的檢出率為14.3%。微小突變與大片段缺失的總檢出率為78.6%。

目前，EGFR受體導向治療前常規進行KRAS基因檢測。單克隆抗體西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗（Panitumumab）的靶點是表皮生長因子受體（EGFR） 和RAS-RAF-MEK-ERK路徑，在治療轉移性CRC方面發揮重要作用。KRAS突變、野生型KRAS但BRAF或PIK3CA突變，對表皮生長因子受體導向治療無反應。