小鼠睪丸組織中轉錄因子Elk1 cDNA的克隆

廖梅堅 余裕強 朱良杰 孫家振 朱波 張學明

·實驗研究·

小鼠睪丸組織中轉錄因子Elk1 cDNA的克隆

廖梅堅 余裕強 朱良杰 孫家振 朱波 張學明

為了確定Ets家族轉錄因子Elk1在睪丸組織中有無表達，提取了正常小鼠睪丸組織的總RNA，經RT-PCR、序列測定證實Elk1在正常小鼠睪丸組織中有表達，為進一步探討其與睪丸發育及精子發生的關系奠定了基礎。

Elk1轉錄因子;睪丸;小鼠

精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)微環境的轉錄調控需Ets相關分子(Ets related molecule，ERM)參與［1，2］。ERM是Ets轉錄因子家族的成員之一，該家族至少包括11個亞家族、26個因子，廣泛參與多種細胞的發育、分化、生長、轉化等過程［3］。目前還不知道該家族其他分子在睪丸組織中是否表達。本研究旨在通過RT-PCR獲得該家族轉錄因子Elk1基因的部分編碼區，并對其序列進行分析，以確定其在正常睪丸組織中有無表達，為進一步探討其與睪丸發育及精子發生的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、材料 7～8周齡、體重30～35 g的成年雄性昆明白小鼠4只，頸椎脫臼法處死后取睪丸放入液氮，后移入-70°C冰箱保存。大腸桿菌DH5α株為本室保存，克隆載體pMD18-T、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、反轉錄酶、RNase、Olig-dT、RNase抑制劑均購自于Takara。DL2000、質粒提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒均購自于北京Tiangen。Trizol試劑購自Invitrogen，焦磷酸二乙酯(DEPC)、瓊脂糖均購自Sigma，其他常用試劑購自于長春寶泰克。

1.2 引物設計［4，5］根據GenBank發表的Elk1的全序列設計合成特異性引物。Elk1的上、下游引物分別為:5'-CCTGAACTCTCCAGTTAGCC-3'，5'-CG TCTCCTACTTCAATGGTG-3'擴增片段大小為191bp。

1.3 睪丸組織總RNA的提取及RT-PCR［4，5］參照試劑盒說明，采用Trizol一步法提取睪丸組織總RNA，電泳檢測其完整性。采用常規方法進行反轉錄PCR反應，反應條件為:94° C預變性5 min，94°C變性30 s，退火30 s(Elk1的退火溫度分別為58.2)，72°C延伸1 min，72°C擴增10 min，循環數均為35個。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，在紫外燈下觀察結果并拍照。采用DNA片段凝膠回收試劑盒按說明回收PCR產物。

1.5 克隆載體構建及測序［4，5］將PCR產物與pMD18-T載體4℃下連接過夜，構建重組質粒pMD-Elk1，經轉化、篩選、質粒提取、PCR鑒定后，將陽性菌液制成甘油菌，送北京英俊公司測序。

2 結果

2.1 睪丸組織總RNA提取及Elk1的PCR擴增 將提取的總RNA凝膠電泳后在紫外燈下觀察，可以見到2條清晰的電泳條帶，分別為28S和18S，說明RNA提取成功，無降解。Elk1的RT-PCR擴增產物凝膠電泳后在紫外燈下觀察到一條大小在100-250bp間的清晰條帶，與預期目的帶大小191bp相符。

2.3 Elk1的序列測定 測序結果顯示，所獲Elk1 cDNA完全正確。表明本實驗正確克隆了Elk1基因，與預期結果相符。

3 討論

Trizol一步法提取RNA避免了傳統提取方法的繁瑣過程和質量不理想等問題。為獲得高質量的RNA，提取中所有用具均需RNA酶抑制劑DEPC處理，玻璃器皿180℃干烤8 h以上，提取前無菌操作間紫外照射2 h以上。操作中經常更換手套，防止皮膚上帶有的RNA酶降解組織中的RNA。此外，還要注意內源性RNA酶所造成的RNA降解。處死小鼠后應迅速取睪丸并立即放入液氮。為保證RNA的提取率，同時也有利于下一步的RNA純化，取材量要大。加入Trizol后的反應時間適當延長，從而保證組織充分裂解。加大氯仿用量和延長反應時間，離心后只取上層清液，這樣從睪丸組織中提取的總RNA回收率很高，質量也較為理想。有了高質量的總RNA，采用常規RT-PCR即可獲得目的基因cDNA，從電泳結果及序列分析結果看，所獲片段大小及核酸序列與預期完全一致。本結果為下一步利用熒光定量PCR、原位雜交等方法深入分析Elk1的表達量及準確部位，揭示其與睪丸發育、精子發生等的關系奠定了基礎。

［1］Chen C，Ouyang W，Grigura V，Hassell JA，Chandrashekar V，Hofmann MC，et al.ERM is required for transcriptional control of the spermatogonial stem cell niche. Nature， 2005，436: 1030-1034.

［2］Schlesser HN，Simon L，Hofmann MC，Murphy KM，Murphy T，Hess RA，et al.Effects of PEA3(ets variant gene 5)on testis and body growth，time course of spermatogonial stem cell loss，and fertility in mice.Biol Reprod，2008，78:483-489.

［3］Gutierrez-Hartmann A，Duval DL，Bradford AP.ETS transcription factors in endocrine Systems.Trends Endocrinol Metab，2007，18 (4):150-158.

［4］F奧斯伯，R布倫特，RE金斯頓，等.精編分子生物學實驗指南.嚴子穎，王海林，譯.北京:科學出版社，1998.

［5］J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南.第二版.金冬雁，黎孟楓，譯.北京:科學出版社，1995.

國家自然科學基金(項目編號:30771555);吉林大學及吉林大學農學部大學生科技創新計劃項目(項目編號:2010B81157，200981SA14)

130062吉林大學畜牧獸醫學院

張學明