種子染菌成因探析及防治

何鑒清

(江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500)

種子染菌成因探析及防治

何鑒清

(江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500)

種子染菌嚴重影響發酵生產，會增加生產成本。文章分別從物品滅菌、種子制備環境、無菌操作和設備等幾個方面來闡述維生素C菌種在制備過程中的種子帶菌原因，操作人員在工作中的注意事項，以及誤判為種子帶菌等情況，并用實例加以分析說明，提出防治措施，在菌種生產中對避免和防止雜菌污染具有一定指導意義。

發酵；種子；無菌室；操作；染菌；滅菌

維生素C發酵屬于液體深層發酵，防止雜菌污染的工作尤為重要。特別是二步種子易被雜菌污染，導致周期延長，產量下降，嚴重影響發酵生產。科技書上指出：一般種子帶菌或懷疑種子帶菌占發酵染菌率的9.64%，居發酵污染概率的第三位[1]。懷疑而不能確認是由于確認的手段欠缺，光學鏡檢不能確認微米生物粒子的污染，種子是否在選育中已被溫和性噬菌體污染就更加難以確認。一旦出現種子染菌，要及時組織調查，根據鏡檢、無檢平皿、留樣情況，再結合操作人員的回憶分析，找出種子染菌的原因和可能性，采取有效手段彌補一切可能引起種子染菌的漏洞，有針對性地解決問題。

1 種子染菌原因分析及防治

造成種子染菌的原因錯綜復雜，通過仔細觀察和認真分析，歸納出以下幾個方面：（1）高溫高壓蒸汽滅菌不徹底；（2）紫外線滅菌不徹底；（3）無菌室的無菌條件不符合要求；（4）操作不當造成染菌；（5）設備以及其它原因引起的染菌。

1.1 高溫高壓蒸汽滅菌操作中注意事項

高溫高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產生的高溫以及熱蒸汽的穿透力，使微生物細胞中的蛋白質極易凝固變性，引起微生物的死亡，從而達到滅菌的目的[2]。

高溫高壓蒸汽滅菌操作時應注意以下幾點：（1）排盡滅菌器中的殘留空氣及蒸汽管道中的冷凝水，否則壓力表所顯示的壓力是水蒸汽和部分空氣壓力總和，不是水蒸汽的實際壓力，這時溫度與壓力不成比例，造成滅菌不徹底而且滅菌時間長。（2）在滅菌物品的簍子上粘貼蒸汽滅菌化學指示劑，觀察變色是否均勻，來證明滅菌是否徹底。注意化學滅菌指示劑貯存條件為室溫20℃，相對濕度50%以下，避免太陽光、熒光燈、紫外燈照射。（3）滅菌完畢后，壓力降為“0”時緩緩開門，不然會造成瓶內的液體突然沸騰上升，將塞子頂出或沖濕，這樣極易染菌。

實例一：操作人員使用蒸汽滅菌器對固體培養基滅菌后，將分裝固體培養基的平皿倒置培養1天后，部分平皿中的培養基上、中、下層都出現細小的白色顆粒，培養二三天后那些白色顆粒處陸續長出雜菌菌落，鏡檢是陽性芽孢桿菌。經過觀察分析，懷疑那白色顆粒是部分瓊脂沒有化開，8瓶培養基中可能有2-3瓶消不透，說明蒸汽滅菌器內溫度達不到規定溫度，且熱量不均勻。

分析：（1）蒸汽滅菌器內冷空氣未排盡；（2）蒸汽滅菌器的冷凝水排水不暢通。

檢查：蒸汽滅菌器冷凝水排水管出口在底樓，有人用拖把堵在出汽口造成管道不暢通，拖把清理后，將進入滅菌器前的蒸汽管道內冷凝水排放幾分鐘，然后開滅菌器進汽閥門，再將滅菌器內冷凝水排放5分鐘以上，最后啟動滅菌器開始工作。從此再也沒有出現上述情況，說明判斷正確。

結論：蒸汽滅菌器操作前必須排空蒸汽管道內的冷凝水及冷空氣，再對物品進行滅菌，在滅菌過程中溫度與壓力成比例。一般蒸汽滅菌不徹底易染陽性芽孢桿菌。

1.2 紫外線滅菌

紫外線滅菌是因為紫外線引起細胞內的核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾核酸的復制造成細胞損傷，另外紫外線還可使空氣中的氧分子變成臭氧，也有殺菌作用[3]。紫外線對革蘭氏陰性菌、噬菌體最敏感，陽性菌次之，但對芽孢桿菌及霉菌孢子不容易殺死。由于紫外線穿透力極低，一般限于對無菌室內空氣及物體表面的滅菌。紫外線長期使用后能量逐漸衰減，殺菌效果亦降低，所以，（1）一般紫外燈管照射2000h必須更換新的紫外燈管；（2）部分細菌具有光復活作用，開紫外燈時不要同時開日光燈；（3）因為紫外線不能穿透玻璃，紫外線燈管不能裝入照明燈罩（玻璃板）里面。

1.3 無菌室的無菌條件要符合要求

空調凈化系統是采用初效、中效、高效過濾器三級過濾，以獲得所需的大量無菌空氣，來保證無菌室“四度”符合要求，無菌室內的無菌條件必須符合以下幾點要求：

（1）無菌室必須符合GMP要求。（2）初效、中效、高效過濾器必須定期更換，每年對高效過濾器做泄漏檢查，確保高效過濾器檢測合格才能使用。（3）每天要數次巡回檢查空氣凈化系統的溫度、濕度、壓差等情況。溫度控制在20℃-22℃，相對濕度控制在55%-60%，壓差≥10Pa為宜。打掃無菌室出風口時一定記住恢復風閥原位，不然無菌室內的壓差會發生變化。（4）定期對無菌室的沉降菌、塵埃粒子數、風速、浮游菌等進行環境監測。根據環境監測情況及時做好清潔、滅菌處理工作，確證無菌室的無菌條件都合格。如果監測到有極少量≥5μm塵埃粒子數，說明無菌室衛生打掃不徹底。（5）定期用臭氧消毒器對無菌室內空氣消毒，來減少空氣中的浮游菌。

實例二：有一次月環境監測各項數據正常，不久操作人員在4#層流罩下制備種液，種液鏡檢、無檢都不染菌，此種液上罐后，小罐終點留樣染菌，仔細查找原因發現是由于4#層流罩風速由原4.2m/s下降到2.6m/s（風速標準為大于3.0m/s），維修后未再出現以上問題。

規定：必須不定期測風速，來了解空氣的流動速度是否達標。

1.4 操作過程中認真操作及注意點

操作人員首先要樹立無菌觀念，無菌室只是相對無菌，大自然中有無數塵埃粒子，人是帶菌者，必須保持個人衛生，要勤用75%的酒精棉球對雙手認真消毒；操作時要一絲不茍，盡量不講話、減少走動，嚴格按操作規程操作；要保持瓶壁外無種液培養基及菌液；移種過程塞子不可被培養基蘸濕；操作時碰到不潔物應廢棄；發酵現場進行種液移種到小罐時，一定要在火焰范圍內操作，這樣可減少操作時被雜菌污染的機會，同時要克服麻痹、僥幸心理。

發酵現場消毒工、看罐工若不能正確地操作，都會誤導種液的無菌度。如：消毒工在消毒過程中滅菌不徹底以及誤將空氣過濾器的濾芯消化，看罐工操作時掉零磅、泡沫冒頂等等造成小罐染菌，在不知情的情況下都誤判為種子帶菌。

實例三：G組的種液鏡檢，無檢平皿，留樣，發酵瓶24h、48h樣都不染菌，此種液接入218#小罐，小罐終點不染菌（這時菌種室鏡檢人員發現發酵瓶72h樣中有極少量的陽性桿菌，決定對G組種液停止供種），又接入228#中罐，中罐終點不染菌，再接入239#大罐，大罐培養32h時發現有少量的陽性桿菌，直到大罐發酵終點雜菌量不多，（發酵罐內雜菌形態與G組發酵瓶72h染的雜菌形態相同）。

分析：操作過程中有極少量的微生物掉入種液瓶中，不易被留樣到，只有通過幾次擴大培養才能發現。

實例四：懷疑C組上批種液染菌，禁止上罐。為了趕進度，C組操作人員接種時用G組正在搖床上已培養22小時未做鏡檢的其中2只搖瓶培養液作為母種接種（僥幸心理認為不染菌）。C組合瓶后鏡檢正常，種液接入小罐生長正常，再接入中罐，中罐終點發現染少量陰性桿菌，反查小罐終點留樣中有極少量陰性桿菌，而G組10桶種液鏡檢正常上罐后，只有1只中罐培養16小時發現染陰性菌，其余都不染菌。

分析：由于中罐C組、G組染的陰性菌的菌形一樣，懷疑G組在無菌室接種過程中可能只有2-3只搖瓶染有極少量陰性菌，恰好是從G組拿到C組的2只搖瓶可能就是其中的1-2只，由于陰性菌的數量極少，逃過了菌種室鏡檢人員的“眼睛”，C組種液經過冷藏、再擴大培養后，雜菌在小罐培養后期就出現了。

規定：不允許用未經證實是無雜菌的種液作為母種擴大培養。

1.5 如何避免設備及其它原因造成種子染菌

（1）菌種生產設備狀況也影響種子無菌度。如：層流罩有漏點；臭氧消毒器失靈；搖瓶機轉速過快，沖程過大或搖瓶內液體裝得太多，在搖瓶機上搖動時，液體濺到塞子上易引起染菌；恒溫培養箱的溫控要好，若失靈有時會誤判染菌，所以鏡檢人員要積累生產經驗來增強判斷能力。（2）發酵現場設備的好壞也會影響種液的無菌度。如：罐體、管道上有沙眼（很難看出）、總空氣系統帶菌以及不明原因染菌的情況下都誤判為種子帶菌。（3）菌種生長必須有一個清潔的環境。潔凈區域墻壁、地面及設備都必須用消毒劑認真擦洗，空間采用消毒劑噴霧處理。消毒劑每月更換，防止產生耐藥菌株。（4）如果分離平皿染菌、茄瓶斜面染菌或種液染菌，立即將所有物品高溫滅菌倒入下水道，對所用設備和無菌室必須用消毒劑反復認真擦洗，空間噴霧消毒，并開紫外燈及臭氧滅菌。

2 結語

雜菌無孔不入，因此不能機械地孤立認為某種染菌現象必定是某一原因或渠道所致，應當把染菌的時間、菌形和雜菌存在的環境等方面的情況聯系起來加以綜合分析，才能作出符合實際的正確判斷，從而采取相應的有效措施，制服染菌。總之，只要各級操作人員工作負責，設備完好，種子不帶菌，小罐染菌率會降至0。

[1]陳代杰,朱寶泉,等.工業微生物菌種選育與發酵控制技術[M].上海:上海科學技術文獻出版社,1994.

[2]林雅蘭,羅大珍,等.微生物學[M].北京:北京大學出版社,2011. [3]王宜磊,等.微生物學[M].北京:化學工業出版社,2010.

Cause Analysisand Prevention of BacterialContam ination of Seed

HE Jian-qing
(Aland(Jiangsu)NutraceuticalCo.,Ltd.,JingjiangJiangsu214500,China)

Bacterial contamination of seed affects fermentation production seriously,and canincrease costof production greatly.In this paper,Iw illanalysis the cause ofbacterialcontamination of seed of vitamin C during the preparation process,mattersneeding attention for operators atwork,andm isjudgmentof contaminated seed from some aspects as follows:sterilization,seed preparation environment,aseptic technique and equipment.Then Iw ill illustratemy view w ith some examples and give some advice for controlmeasures.Ithink this paperhave agreatsignificance to avoid and preventbacterial contam ination during the production.

fermentation;seed;sterile room;operating;contam ination;sterilization

Q93

A

1671-0142（2011）05-0076-03

何鑒清（1964-）,女,江蘇靖江人,工程師.

（責任編輯 李冠楠）