巰基轉移酶與晶狀體氧化還原調控

廖 萱，蘭長駿

(川北醫學院附屬醫院眼科，四川 南充 637000)

白內障的發生是一個復雜的過程，大量的實驗和臨床研究提示氧化應激與白內障有密切關系。氧化還原系統失衡導致細胞內氧自由基生成增加和細胞膜功能障礙，引起晶狀體纖維蛋白的結構和構象改變，導致晶狀體混濁。研究顯示:在各種氧化應激損傷過程中，細胞內氧化還原調節的關鍵是蛋白質巰基(-SH)被氧化形成二硫鍵(-S-S-)，導致蛋白二硫化物的形成。目前已知的細胞內負責二硫化物還原的系統主要是巰基-二硫鍵還原酶家族，巰基轉移酶(thioltransferase，TTase)是這個家族的重要組分［1］。近年來對TTase系統的研究日益受到重視，對細胞氧化還原機制的認識也進一步加深。研究表明，TTase對還原蛋白二硫化物的二硫鍵具有高度的特異性，是機體中催化蛋白二硫化物還原唯一的酶［2］。TTase可在其活性位點和對應二硫化物的半胱氨酸殘基完成可逆的巰基-二硫鍵交換反應，調節蛋白質巰基或二硫鍵發生氧化還原所致的蛋白分子構型改變，從而阻抗蛋白質的氧化應激損傷或恢復受損蛋白質的生物活性［3］。TTase通過細胞內氧化還原的調節，在體內氧化防御體系中發揮著重要作用，并由此衍生出諸多細胞內外功能。

1 概況

1.1 分布:巰基轉移酶又稱為谷氧還蛋白，廣泛存在于原核、真核生物中，一般含有100個左右氨基酸殘基，由Askelof等［4］1974年在大鼠肝組織首次發現，并指出此酶催化巰基-二硫鍵交換。1976年Holmgren等［5］在缺失 Trx基因的大腸桿菌中發現TTase利用輔酶Ⅱ(NADPH)傳遞的電子還原靶蛋白中的二硫鍵，參與DNA合成。目前學者們已在大部分的生物體中發現TTase，并得到深入廣泛的研究。

對于眼組織中 TTase的研究由 Raghavachari［6］等首次報導，指出TTase主要集中于晶狀體，分子量為11.5kDa，在大鼠、豬、牛、豚鼠、雞胚胎和人類的晶狀體中功能和結構相似;TTase在晶狀體上皮細胞中分布均勻且含量較皮質和核更高，其活性有賴于谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)和 NADPH，在 30℃、PH 7.4的磷酸鹽緩沖液中表現出最大活性。隨后在1997年克隆了來源于人晶狀體的 TTase cDNA［7］。Wu［8］證實在大多數眼組織中發現TTase，其在眼組織的分布主要集中在眼前節，在晶狀體上皮細胞中的活性遠大于晶狀體皮質和核，玻璃體中沒有檢測到具有活性的TTase。人晶狀體TTase可以高效還原蛋白二硫化物混合物和具有脫氫抗壞血酸還原酶活性，其結構和功能特性與豬肝臟和人胎盤TTase完全相同［9］。

1.2 結構和分類:TTase蛋白具有3個活性區域，即暴露于蛋白表面的巰基-二硫鍵活性位點CXXC或CXXS，還原型谷胱甘肽(GSH)結合位點，和疏水性表面區域。TTase通常以氧化態或者還原態存在。典型的TTase有兩個半胱氨酸殘基(-Cys)，氧化態時兩個半胱氨酸殘基的巰基以分子內部二硫鍵的形式連接，還原態時C端和N端半胱氨酸殘基的巰基形成鄰位雙巰基活性中心，提供參與蛋白質巰基-二硫鍵轉換的側鏈基團-SH;附近的GSH結合位點用以結合還原型GSH并共同作用于蛋白質二硫鍵。

在不同生物體中有多種不同結構和催化功能的TTase異構體。根據結構和催化特點可以大致分為四類:第一類具有典型的二巰基活性位點序列CXXC和標準的折疊結構，是核糖核苷酸還原酶的電子供體，分子量約為10kDa。第二類具有二巰基活性位點序列CPYC(Cys22-Pro-Tyr-Cys25)，主要由含有活性位點的折疊區和α螺旋構成，具有TTase的氧化還原酶活性。第三類具有單巰基活性位點序列CXXS，對其底物有相當的特異性。第四類植物CC型，較其它物種的TTase研究少。人類的TTase有兩種同工酶，分別定位于5q14和1q31.3。

1.3 生理功能:TTase是巰基－二硫鍵氧化還原酶家族的重要組成部分，在體內通過廣泛的途徑進行氧化還原調節，提供細胞質內的還原環境，抵抗氧化應激損傷［10］。TTase可恢復細胞內一些含有半胱氨酸殘基的抗氧化蛋白和轉錄因子的活性，從而阻抗和治療活性氧導致的細胞氧化應激損傷［11］。William A［12］等研究發現，大腸桿菌中還原型谷胱甘肽(GSH)多于氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH∶GSSG比例達50－200∶1，推測大腸桿菌內TTase利用還原型GSH對維持巰基基團的還原狀態起了一定的作用。在正常情況下，動脈平滑肌細胞內TTase也有所表達，說明TTase在正常情況下維持細胞內還原環境的重要作用。TTase的抗氧化作用還表現在細胞受到氧化應激后其基因表達增加，通過表達上調來抵抗氧化應激、保護細胞免受氧化損傷。Raghavachari［13］等報導在氧化應激條件下，人晶狀體上皮細胞TTase表達上調，參與晶狀體上皮細胞氧化還原狀態的維持。Lofgren［14］發現敲除 TTase的小鼠晶狀體上皮細胞(TTase□/□)抗氧化應激能力低于野生型(TTase+/+)，這些細胞更難存活和更多凋亡，移除H2O2的能力減弱。將純化TTase重新加載到TTase□/□細胞，細胞抗氧化功能修復至接近正常狀態。

TTase也是一種具有多種生物學功能的多效性細胞因子，參與生命活動的許多環節。通過其半胱氨酸殘基上巰基和二硫鍵的可逆轉換，可以改變某些功能性蛋白分子的構型，調控蛋白分子的活性、穩定性與正確折疊等，在信號轉導通路中起著重要作用。TTase能與細胞凋亡的信號調控激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)結合并抑制其活性;葡萄糖誘導的氧化應激代謝能激活ASK1-MEKMAPK信號轉導通路和使TTase從ASK1上分離;通過Ras-PI3K-Akt-NFκB途徑，使NF-κB的DNA結合能力加強，抑制神經遞質多巴胺(DA)對細胞氧化應激損傷所介導的凋亡。TTase還對轉錄因子AP-1、NF-1、Atf1和Pap1進行復雜調控。

2 抗氧化作用機制

機體組織或細胞受到氧化應激損傷后，脆弱的蛋白質巰基與非蛋白巰基配對形成二硫鍵-S-S-，形成蛋白質-S-S-谷胱甘肽(Pr-S-S-G)，或蛋白質-S-S-半胱氨酸(Pr-S-S-C)和蛋白質-S-S-γ-谷氨酰半胱氨酸等形式的蛋白質巰基二硫化物混合物。TTase利用谷胱甘肽作為輔酶，催化二硫化物的二硫鍵還原為巰基，恢復蛋白質結構和功能，從而對抗和修復活性氧所導致的氧化應激損傷，維持體內穩定的氧化還原狀態。具有谷胱甘肽化作用的蛋白還包括蛋白分子伴侶、細胞骨架蛋白、細胞周期調節子等。

2.1 單巰基機制:催化還原蛋白與小分子形成的混合二硫鍵，如蛋白谷胱甘肽二硫化物(Pr-S-S-G)時，TTase僅利用N端半胱氨酸的巰基［15］，即兩個還原狀態半胱氨酸的巰基中只需其中一個起作用，這一機制稱為單巰基機制。研究證明，單個的半胱氨酸即可提供還原Pr-S-S-G的二硫鍵活性。由于TTase對谷胱甘肽具有親和力，TTase并不作用于Pr-S-S-G的蛋白底物本身，而是與其谷胱甘肽部分-S-S-G特異地相互作用，形成中間物TTase-S-S-G，并釋放還原態目標蛋白 Pr-SH。TTase-S-S-G再被第二個GSH分子還原成為谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，谷朧甘肽還原酶(GR)利用磷酸戊糖途徑提供的NADPH為供氫體，將GSSG還原為GSH。

2.2 二巰基機制:除單巰基還原機制外，TTase催化氧化還原機制還包括二巰基還原機制。二巰基機制是對蛋白質內二硫鍵的還原，催化還原通常發生在TTase上的兩端半胱氨酸上，且TTase兩個還原狀態的半胱氨酸的巰基都是必需的。N端半胱氨酸暴露成為TTase活性位點攻擊蛋白分子內二硫鍵，在TTase和蛋白底物之間形成混合二硫化物。然后另一活性位點C端半胱氨酸去質化，攻擊N端形成分子內二硫鍵;同時蛋白底物與TTase形成的混合二硫化物的-S-S-被還原，從而產生還原態目標蛋白Pr-(SH)2，以及氧化態 TTase-S2。

3 TTase與晶狀體的氧化還原

晶狀體存在多重抗氧化屏障維持著氧化還原狀態的平衡。在正常晶狀體中，絕大部分蛋白質巰基處于還原態，以穩定晶狀體纖維蛋白的結構和排列，而晶狀體纖維蛋白的結構和排列關系決定了晶狀體的透明性。由于晶狀體蛋白含較多對氧化作用敏感半胱氨酸和巰基，易于形成二硫鍵;在氧化應激下，半胱氨酸的巰基被氧化成可逆再生的分子內/間二硫鍵形式，晶狀體蛋白以二硫鍵相互連接形成聚合體，聚合體之間再以非共價鍵相連，從而產生巨大分子的高分子量蛋白(HM)，并組成水不溶性蛋白，光散射增加，蛋白結構改變，內在修復酶系統功能被破壞，晶狀體發生混濁。

研究表明，TTase對維持晶狀體巰基-二硫鍵氧化還原內環境的穩定至關重要，可能在保護晶狀體免受氧化應激損傷方面發揮著重要作用。Raghabachari［13］等將人晶狀體上皮細胞(HLEB3)暴露于0.1mmol H2O2，觀察到TTase的活性與H2O2呈時間依賴關系，5分鐘時TTase mRNA的表達開始增加，10分鐘后達最高水平，60分鐘恢復至正常水平。兔晶狀體上皮系(N/N 1003A)較之人晶狀體上皮細胞(HLEB3)的抗氧化活性更強，對H2O2的耐受劑量差異達5倍［16］。但長時間暴露于更高濃度的H2O2下會導致TTase下調。Wang［17］等將豬晶狀體暴露在不同濃度(0.1mmol-10mmol)H2O2下培養，發現24小時后濃度0.1 mmol H2O2組活性下降了12%，1.5 mmolH2O2組活性下降了45%，10 mmol H2O2組幾乎不能檢測到 TTase，證實 TTase的活性與H2O2呈濃度依賴關系。Moon［18］等研究發現，在氧化應激下培養的豬晶狀體的晶狀體上皮細胞層TTase活性、蛋白表達以及mRNA轉錄增加，輕度H2O2刺激下TTase活性呈現緩慢的增加，強H2O2刺激下酶活性快速增加，隨后穩定下降;沒有H2O2刺激的對照組，酶活性和表達在整個實驗期維持穩定。在氧化應激早期表現為TTase表達上調，提示TTase在早期防御中的重要性，發揮著保護晶狀體蛋白和酶的重要功能;但長期處于氧化應激狀態下，超過TTase對抗氧化應激的能力，則會損害TTase系統，導致TTase活性和含量下降。

TTase特異性地使晶狀體蛋白質氧化形成的二硫鍵斷裂，并在其活性位點的Cys與對應二硫化物之間進行巰基－二硫鍵交換，從而恢復蛋白質的自由巰基，調控細胞內巰基/二硫化物的穩態，阻止晶狀體蛋白形成交聯。除了作為細胞內防御系統對抗氧化損傷而保護晶狀體蛋白，TTase對晶狀體氧化損傷也有修復的作用。TTase可通過還原蛋白質谷胱甘肽二硫化物等過程來調節和修復晶狀體中含巰基的蛋白質或酶的活性，恢復其還原狀態和生理功能，保持糖代謝和提供維持細胞活力所需的能量［19］，有助于晶狀體透明性的恢復。脫氫抗壞血酸是一種存在于房水和晶狀體的氧化物，能誘導白內障的形成;TTase催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸［20］，保護晶狀體。TTase可以還原在氧化應激作用下晶狀體中某些活性降低或丟失的抗氧化酶。Lou［21］等實驗發現，將兔晶狀體上皮細胞暴露于0.5 mmol H2O2，5分鐘后晶狀體中重要的糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G-3PD)的活性丟失至20%，加入重組人晶狀體TTase(RHLT)后，其活性增加至60%;經胱氨酸去巰基滅活的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)，加入RHLT 30分鐘后活性恢復至初始水平的90%。體外研究中谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的催化功能很容易通過S-半胱氨?；Щ?，通過TTase催化后活性可恢復。通過對TTase和GST的對比研究，發現晶狀體TTase在還原晶狀體蛋白質巰基混合的二硫化物活性方面比GST高60%－70%，TTase和GST聯合作用于晶狀體巰基二硫化物混合物沒有累加效應［20］。谷胱甘肽還原酶(GR)在維持晶狀體的巰基基團也發揮了關鍵作用，其活性隨著晶狀體老化和白內障形成降低;而TTase能有效恢復人白內障晶狀體GR活性［22］。在氧化應激的條件下培養的人和兔眼晶狀體上皮細胞，當其他氧化防御系統如GPx和GR嚴重滅活時，TTase仍有顯著的抗氧化的功能。Xing［23］比較不同年齡組的正常人晶狀體發現，隨著年齡的增加TTase和TRx系統的活性逐漸丟失，可能導致老化人口患白內障的風險增加。

4 結束語

綜上所述，TTase在保護晶狀體蛋白質免受氧化損傷，防止晶狀體的白內障形成中發揮重要作用。TTase在晶狀體的表達和活性的研究對于探討白內障發病機制有重要意義，并將為白內障的藥物預防和治療提供廣闊的前景。

［1］ Holmgren A.Antioxidant function of thioredoxin and glutaredoxin systems［J］.Antioxid Redox Signal，2000，2(4):811 － 820

［2］ Rebrin I，Kamzalov S，Sohal RS.Effects of age and caloric restriction on glutathione redox state in mice［J］.Free Radic Biol Med，2003，35(6):626 －635

［3］ Fladvad M，Bellanda M，Fernandes PA ，et al.Molecular Mapping of Functionalities in the Solution Structure of Reduced Grx4，a Monothiol Glutaredoxin from Escherichia coli［J］.JBiol Chem，2005，280(26):24553 －24561

［4］ Askelof P，Axelsson K，Eriksson S，et al.Mechanism of action of enzymes catalyzing thiol－ disulfide interchange.Thioltransferases rather than transhydrogenases［J］.FEBSLett，1974，38(3):263 －267

［5］ Holmgren A.Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside diphosphate reductase dependent upon glutathione［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1976，73(7):2275－2279

［6］ Raghavachari N，Lou MF.Evidence for the presence of thioltransferase in the lens［J］.Exp Eye Res，1996，63(4):433 －44 l

［7］ Raghavachari N，Shinohara T，Kikuchi T，et al.Cloning，expression and characterization of TTase cDNA from human lens［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1997，38(5):581

［8］ Wu F，Wang GM，RaghavachariN，Lou MF.Distribution of Thioltransferase(Glutaredoxin)in Ocular Tissues［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39(3):476 －480

［9］ Raghavachari N，Qiao F，Shinohara T，et al.Cloning，high levelexpression and characterization of human lens thioltransferase［J］.Exp Eye Res，1998，66(4):465 －475

［10］ LiM，Yang Q，Zhang L，et al.Identification of novel targets of cyanobacterial glutaredoxin［J］.Arch Biochem Biophy，2007，458(2):220－228

［11］ Bandyopadhyay S，Starke DW，Mieyal JJ，et al.Thioltransferase(glutaredoxin)reactivates the DNA-binding activity of oxidationinactivated nuclear factor I［J］.JBiol Chem，1998，273(1):392－397

［12］ William A Prinz，Fredrik Aslund.The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm［J］.J Biol Chem，1997，272(25):15661－15667

［13］ Ragbavacbari N，Krysan K，Xing K，et al.Regulation of thioltransferaseexpression in human lens epithelial cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42(5):1002 － 1008

［14］ Lofgren S，Fernando MR，Xing KY，et al.Effectof thioltransferase(glutaredoxin)deletionon cellular sensitivityto oxidative stressand cell proliferationin lens epithelial cellsof thioltransferase knockout mouse［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(10):4497 － 4505

［15］ Qin J，Yang Y，Velyvis A，et al.Molecular views of redox regulation:three－ dimensional structures of redox regulatory proteins and protein complexes［J］.Antioxid Redox Signal，2000，2(4):827－840

［16］ Xing K，Lou MF.Effect of H2O2 on human lens epithelialcells(B3)and the possible Mechanism for OxidativeDamage Repair by Thioltransferase［J］.Exp Eye Res，2002，74(1):113 － 122

［17］ Wang GM，Raghavachari N，Lou MF.Relationship ofprotein－glutathionemixed disulfide and thioltransferase inH2O2-induced cataract in cultured pig lens［J］.Exp Eye Res，1997，64(5):693 －700

［18］ Moon S，Fernando MR，Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress［J］.InvestOphthalmol Vis Sci，2005，46(10):3783－3789

［19］ Rachdan D，Lou MF，Harding JJ.Revival of inactive glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase in human cataract lenses by reduction［J］.Exp Eye Res，2004，79(1):105 －109

［20］ Lou MF.Redox regulation in the lens［J］.Prog Retin Eye Res，2003，22(5):657 －682

［21］ Lou MF，Wang GM，Wu F，et al.Thioltransferase ispresent in the lens epithelial cells as a highly oxidativestress－resistant enzyme［J］.Exp Eye Res，1998，66(4):477 － 485

［22］ Rachdan D，Lou MF，Harding JJ.Glutathione reductase from human cataract lenses can be revived by reducing agents and by a molecular chaperone，alpha-crystalline［J］.Curr Eye Res，2005，30(10):919－925

［23］ Xing KY，Lou MF.Effect of age the thioltransferase(glutaredoxin)and thioredoxin systems in the human lens［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010;51(12):6598 － 6604