轉基因骨髓基質細胞治療缺血性腦損傷的研究進展

付霞 何志義(審校)

轉基因骨髓基質細胞治療缺血性腦損傷的研究進展

付霞 何志義(審校)

一、骨髓基質細胞的概述

骨髓基質細胞(marrow stromal cell，MSC)是骨髓內除造血干細胞之外的非造血干細胞，通常稱之為間充質干細胞(mensenchymal stem cell)，非造血干細胞(nonhematopoietic stem cell)或成纖維細胞形集落(colony-forming-unit fibroblast)。早在1867年，德國病理學家Cohnheim在研究創傷愈合時就提出了骨髓中存在非造血干細胞的觀點［1］。20世紀70年代中期Friedenstein等［2］首先利用骨髓基質細胞貼壁生長的特性，通過貼壁培養的方法分離得到了骨髓基質細胞。

以前認為骨髓基質細胞主要起支持作用和分泌各種因子、調節造血細胞的增殖和分化。近來研究表明骨髓基質細胞具有非造血組織干細胞的功能，有極大的可塑性，可因外周的微環境的不同，分化為多種組織細胞［3］。由于骨髓基質細胞取材方便，體外易于分離和擴增，多種外源目的基因可以轉染至骨髓基質細胞基因組DNA中，并能長期表達，移植到體內后免疫原性較弱，能夠通過血腦屏障，與宿主大腦細胞整合，通過自我更新而長期存活，因此骨髓基質細胞成為了一種理想的基因治療缺血性腦損傷的靶細胞。

二、轉染髓基質細胞常用的載體

基因治療的前提是將外源基因有效導入靶細胞并適量的表達，因此合適的基因轉移載體是決定基因治療效果的關鍵。目前實驗中常用的載體主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類，這兩類載體各有優缺點:病毒載體由于其較高的轉染效率而被廣泛應用，但是病毒載體不僅難以操控，而且存在一些安全隱患，比如:免疫反應、感染，以及由于基因改變造成細胞的惡性變或永生化;而非病毒載體雖然轉染效率低于病毒載體，但其具有置備程序比較簡單，外源基因容量大，不受靶細胞分裂周期的影響，以及毒性低等優點。

1.病毒載體:目前實驗中常用于轉染骨髓基質細胞的病毒載體有腺病毒載體(adenovirus vector)、慢病毒載體(lentivirus vector)、單純飽疹病毒載體(herpes simplex virus vector)以及逆轉錄病毒載體(retroviruses vector)等。

(1)腺病毒載體:腺病毒載體是目前轉基因試驗中最常用的病毒載體之一，其具有宿主范圍較廣，不僅能感染能進行分裂的細胞，也能感染不再分裂的細胞如神經細胞的優點。腺病毒載體不整合進宿主細胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細胞基因組外，這樣就避免了病毒載體插入宿主細胞基因組可能引起基因突變等后果，因而使用時更安全。但這同時也造成一些麻煩，由于不整合至宿主細胞基因組，表達外源基因的時間較短(僅數周)，不適合長期表達。因其還有體內的免疫反應和基因容量有限等缺點，限制了腺病毒載體的實際應用和發展。隨著人們對于生物分子和免疫因子在體內作用過程的理解逐漸加深，在過去的幾年里，人們已經在構建更有效的載體方面取得了大跨步的發展。

Hicks等［4］用腺病毒載體將人IL-2基因轉導人骨髓基質細胞，轉導后的細胞第10天的表達量最高，達19350pg(或 38IU)IL-2/106細胞/24h，在13天內能檢測到IL-2的表達，分泌的IL-2在混合淋巴細胞試驗中能促進T淋巴細胞的增殖。Koch等［5］用腺病毒載體將熒光素酶或BMP-2基因轉導入人骨髓基質細胞，證實暴露時間是影響腺病毒載體轉染骨髓基質細胞毒性的重要因素之一，其暴露時間不應超過4個小時，延長暴露時間會導致細胞死亡增加。Mizuguchi等［6］應用經纖維修飾的腺病毒載體轉染骨髓基質細胞，結果超過95%的骨髓基質細胞表達轉基因，其轉基因活性是傳統腺病毒的460倍。

(2)慢病毒栽體:研究表明［7］，以 HIV-1為基礎構建的這類慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、免疫反應小等優點，適于體內基因治療，因此有望成為理想的基因轉移載體。

Zhang等［8］將以HIV-1為基礎構建的慢病毒載體攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉染骨髓基質細胞獲得了較高的轉染效率，EGFP表達時間超過5個月，而且慢病毒轉染不影響BMSCs傳代并分化為其它功能細胞。Lee等［9］應用含CMV、EF1α或PGK啟動子的慢病毒載體轉染EGFP至胚胎獼猴骨髓基質細胞(rhMSC)，證明含啟動子的慢病毒載體可在體外有效轉染 rhMSC(轉染率:CMV＞EF1α＞PGK)，并且不會抑制rhMSC的分化潛能。McMahon等［10］在實驗中比較腺病毒、腺相關病毒、慢病毒及非病毒載體轉染骨髓基質細胞的效率及毒性，結果慢病毒的轉染率最高，同時細胞毒性很低;腺病毒也有較高的轉染率，但隨著病毒滴度的升高，細胞死亡率明顯升高;腺相關病毒只對兔骨髓基質細胞有效，而對大鼠骨髓基質細胞無效;脂質體有中度的轉染率并伴有一定的細胞死亡，電穿孔被證明無效并有很高的細胞死亡率。

雖然慢病毒載體的體外試驗令人鼓舞，但體內的表達效率還很低。因此，一方面要進一步提高慢病毒載體在細胞中的表達水平，另一方面要提高動物體內表達效率。

(3)單純皰疹病毒載體:單純皰疹病毒載體具有以下優點:①宿主細胞廣泛;②病毒滴度高;③外源基因容量大;④對神經細胞具有嗜向性，可在神經元細胞中建立終生潛伏性感染。HSV載體的不足之處在于它的毒性。

Zhao等［11］應用HSV-1載體轉染肝細胞生長因子(HGF)至骨髓基質細胞，然后用該骨髓基質細胞治療腦缺血大鼠，證明移植后一天MSC-HGF治療組缺血腦組織中HGF蛋白的表達量高于單純MSC治療組，并持續至少兩周。Ikeda等［12］應用HSV-1載體轉染成纖維成長因子-2(FGF-2)至骨髓基質細胞，治療大鼠局灶性腦缺血，也得到了相似的結果。說明HSV-1載體可將外源基因轉染至骨髓基質細胞，并能長期穩定表達。

(4)逆轉錄病毒載體:逆轉錄病毒只感染具分裂復制能力的細胞，骨髓基質細胞在體外培養增殖快，使用逆轉錄病毒轉染相對容易。用逆轉錄病毒轉染骨髓基質細胞，轉染效率報道不一，從18%到99%不等。Bartholomew等［13］已在體內模型上證實了逆轉錄病毒介導外源基因轉染骨髓基質細胞的可行性。他們將人促紅細胞生成素(hEPO)基因轉染給狒狒的骨髓基質細胞，可以異體或自體移植。能夠在移植后持續137天分泌hEPO，并伴隨狒狒體內紅細胞容積上升。逆轉錄病毒載體難以達到高滴度，而且只能轉導處于分裂期的靶細胞，因此對骨髓基質細胞的轉導效率亦不高，此外由于它可整合至靶細胞染色體的任意位置，因此具有插入突變的潛在危險。基于以上原因，逆轉錄病毒載體在近年來的基因治療研究中地位已有所降低。

2.非病毒載體:非病毒載體中最常用的就是陽離子脂質體。陽離子脂質體是一種本身帶正電的脂質囊泡，它與帶負電的DNA分子穩定結合并能通過細胞的質膜，從而將目的基因傳遞到細胞內與基因組整合。

張紅梅等［14］應用脂質體轉染SCF cDNA至骨髓基質細胞，結果轉染的骨髓基質細胞SCF mRNA水平表達量高于對照組，其細胞培養上清協同GM-CSF刺激骨髓細胞形成集落數比GM-CSF單獨作用高，說明脂質體介導質粒載體轉染培養富集的骨髓基質細胞并表達，且轉染上清具有生物學活性。楊輝俊等［15］用脂質體轉染bFGF基因至骨髓基質細胞，觀察到骨髓基質細胞可穩定表達bFGF蛋白至少4周。李興貴等［16］應用脂質體轉染人神經營養因子-4(hNT-4)至骨髓基質細胞，治療缺氧缺血性腦損傷，應用免疫細胞化學染色和原位雜交分析，證實轉染后骨髓基質細胞可以表達hNT-4蛋白和mRNA。由于脂質體載體的轉染效率非常低，當前的實驗研究中，僅國內有一些研究者應用脂質體載體轉染外源基因至骨髓基質細胞，國外很少應用。

為了提高非病毒載體的轉染效率，德國Amaxa公司研究出了一種新技術——NucleofectorTM技術，其在世界上第一次實現了非病毒載體與高轉染效率的完美結合，特別適用于轉染原代細胞和難于轉染的細胞系［17，18］。該方法將傳統的電穿孔技術和專用的轉染試劑結合起來，針對不同的細胞類型，采用一套最理想的轉染試劑和轉染程序，直接將DNA轉染到細胞核內，因而實現了因受到細胞分裂的限制而一直困擾人們的原代細胞的高效率轉染。

Nakashima 等［19］和 Aluigi等［20］分別在不同的實驗中證明NucleofectorTM技術轉染骨髓基質細胞的效率高于其他非病毒載體，Aluigi等［20］還證實NucleofectorTM技術轉染白介素-12基因至骨髓基質細胞后，免疫調節細胞因子可持續大量表達至少3周，并且不會破壞它的生物學活性。

NucleofectorTM技術與脂質體等非病毒轉染載體相比有很多優點:①前者可以直接將目的基因轉染入細胞核;后者是利用脂質體與細胞膜的親合性先將目的基因轉染入細胞漿，然后在細胞分裂時被攝入細胞核。②前者因為結合了電轉與轉染緩沖液，并在實驗室里對特定細胞進行了參數優化;所以其轉染率比后者高。③前者轉染不依賴于細胞分裂，轉染前不需要刺激細胞生長;而且可以成功轉染分裂緩慢的細胞如神經元等。而后者轉染成功與否及轉染率很大程度上依賴于細胞分裂增值活性，轉染前需要刺激細胞成長(如轉染前1天傳代等)，在細胞對數生長期轉染才能獲得好的效果。④前者還有轉染快(電轉僅需3秒)、操作簡單等優點。NucleofectorTM技術的諸多優點，為基因轉染研究以及基因治療的臨床應用提供了一種新的手段。

三、所轉染的目的基因

在轉基因骨髓基質細胞治療缺血性腦損傷的實驗中，其所攜帶的目的基因主要分為兩類:一種是增加療效的神經營養因子基因，另一種是使骨髓基質細胞永生化的人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因。

1.神經營養因子基因:骨髓基質細胞治療缺血性腦損傷的主要作用機制之一就是增加神經營養因子的分泌，為了進一步增加其療效，許多科學家將表達神經營養因子的基因轉染至骨髓基質細胞來治療缺血性腦損傷。Kurozumi等［21］利用一種腺病毒載體分別將BDNF和GDNF基因轉染至骨髓基質細胞，然后將基因修飾的骨髓基質細胞移植到一過性大腦中動脈閉塞模型大鼠的缺血側紋狀體中，結果MSC-BDNF和MSC-GDNF治療組大鼠的神經功能恢復顯著優于對照組，腦梗死灶體積顯著小于單純MSC治療組。Nomura等［22］將BDNF基因修飾的骨髓基質細胞經靜脈途徑移植到永久大腦中動脈閉塞的大鼠模型中，也得到了與Kurozumi等相似的結果。而 Ikeda［12］和 Zhao［11］等則分別應用 FGF-2 和HGF基因修飾的骨髓基質細胞來治療腦缺血大鼠也均取得了優于單純應用MSC的治療效果。

2.人端粒酶逆轉錄酶基因:端粒是真核生物染色體末端的特殊結構，在維持染色體的結構和功能方面起重要作用［23］。在每次細胞分裂時，端粒隨著細胞有絲分裂而逐漸縮短，所以又被稱為“有絲分裂鐘”。目前認為:端粒酶在細胞的衰老、死亡及永生化過程中起著重要作用。成人骨髓基質細胞缺乏端粒酶活性，體外培養只能傳20代左右，極大地限制了臨床研究和應用。導入外源人端粒酶逆轉錄酶基因可激活細胞端粒酶活性，維持端粒長度［24］。樸明學等［25］將外源性hTERT基因導入成人骨髓基質細胞，結果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白質水平均有穩定表達，hMSC-hTERT細胞可穩定傳至第82代，其形態與hMSC有明顯不同，細胞短小，成三角形或棱形，核仁明顯可見，增殖能力強，平均2 d傳代1次，凍存、復蘇不影響其增殖特性，在一定誘導條件下，永生化的hMSC細胞能夠在體外分化成神經元樣細胞。Honma等［26］將外源性hTERT基因導入成人骨髓基質細胞，并應用該永生化的骨髓基質細胞治療一過性大腦中動脈閉塞的大鼠，結果hTERT-MSCs治療組大鼠腦梗死面積小于對照組，神經功能恢復優于對照組。

3.其他基因:另外，還可以將具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因轉染至骨髓基質細胞以提高骨髓基質細胞在體內的存活率。雖然目前還沒有此類報道，但已有相似研究的報道。Wang等［27］已經發現，將bcl-2基因制成轉基因動物后，其高效表達bcl-2蛋白的骨髓基質細胞經無血清培養基處理后自身的凋亡數量少于正常骨髓基質細胞。因此認為，骨髓基質細胞bcl-2基因高表達可減少骨髓基質細胞的凋亡，推測bcl-2轉基因預處理后的個體骨髓基質細胞作為移植供體能提高骨髓基質細胞移植后的成活率。Wei等［28］證實，在體外將bcl-2基因轉染到小鼠胚胎干細胞中，可以增加其在腦缺血大鼠腦內的存活與分化，并促進腦缺血大鼠的神經功能恢復。如果將該實驗中的胚胎干細胞換成更易于獲得的骨髓基質細胞，相信也應該可以得到類似的結果。因此，將具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因轉染至骨髓基質細胞來治療缺血性腦損傷應該是一條可行的途徑。

四、問題與展望

盡管骨髓基質細胞在缺血性腦損傷的治療中顯示了巨大的應用價值，但目前還存在一些問題有待解決:(1)還沒有找到明確而特異的骨髓基質細胞表面細胞標志物進行鑒別;(2)骨髓基質細胞移植后，其遷移、分化的機制仍不明確;(3)植入體內的骨髓基質細胞能否與宿主神經細胞確實建立神經環路仍屬未知，還需要超微結構和電生理方面的研究來證實;(4)移植后只有少量細胞能分化為神經細胞，如何提高其在體內的成活率及向神經細胞分化的能力將是今后研究的一個重要問題。這些問題的解決，將會給缺血性腦血管病的治療帶來一場革命性的進步。

1 Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.Science，1997，276:71-74.

2 Friedenstein AJ，Gorskaja UF，Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hemator，1976，4:267-274.

3 Pittengnre MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adults human mesenchymal stem cells.Science，1999，284:143-147.

4 Hicks C，Keoshkefian E，French R，et al.Adenoviral mediated interleukin-2 gene transfer to human long-term bone marrow stromal cultures.Cancer Biother Radiopharm，200l，16:537-543.

5 Koch H，Jadlowiec JA，Whalen JD，et al.Refined adenoviral transduction for controlled gene transfer into human adult mesenchymal stem cells.Z Orthop Ihre Grenzgeb，2005，143:677-683.

6 Mizuguchi H，Sasaki T，Kawabata K，et al.Fiber-modified adenovirus vectors mediate efficient gene transfer into undifferentiated and adipogenic-differentiated human mesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun，2005，332:1101-1106.

7 Goldman MJ，Lee PS，Yang JS，et al.Lentiviral vectors for gene therapy of cystic fibrosis.Hum Gene Thera，1997，8:2261-2268.

8 Zhang XY，La Russa VF，Bao L，et al.Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells.Mol Ther，2002，5:555-565.

9 Lee CI，Kohn DB，Ekert JE，et al.Morphological analysis and lentiviral transduction of fetal monkey bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Mol Ther，2004，9:112-123.

10 McMahon JM，Conroy S，Lyons M，et al.Gene transfer into rat mesenchymal stem cells:a comparative study of viral and nonviral vectors.Stem Cells Dev，2006，15:87-96.

11 Zhao MZ，Nonoguchi N，Ikeda N，et al.Novel therapeutic strategy for stroke in rats by bone marrow stromal cells and ex vivo HGF gene transfer with HSV-1 vector.J Cereb Blood Flow Metab.2006;26:1176-1188.

12 Ikeda N，Nonoguchi N，Zhao MZ，et al.Bone marrow stromal cells that enhanced fibroblast growth factor-2 secretion by herpes simplex virus vector improve neurological outcome after transient focal cerebral ischemia in rats.Stroke，2005，36:2725-2730.

13 Chuah MK，Van Damme A，Zwinnen H，et al.Long-term persistence of human bone marrow stromal cells transduced with factor VIII-retroviral vectors and transient production of therapeutic levels of human factor VIII in nonmyeloablated immunodeficient mice.Hum Gene T-her，2000，11:729-738.

14 張紅梅，陳玉丙，朱迅.小鼠干細胞因子基因以脂質體介導轉染骨髓基質細胞.中國老年學雜志，2004，24:153-154.

15 楊輝俊，沈強，陳堯，等.bFGF基因轉染骨髓基質細胞后的表達.中華醫學叢刊，2004，4:3-5.

16 李興貴，賈延，楊于嘉，等.NT24轉染骨髓基質細胞移植治療新生大鼠缺氧缺血性腦損傷.重慶醫學，2004，33:389-391.

17 Hamm A，krott N，Breibach I，et al.Efficient transfection method for primary cells.Tissue Eng，2002，8:235-245.

18 Distler JH，Jungel A，Kurowska-Stolarska M，et al.Nucleofection:a new，highly efficient transfection method for primary human keratinocytes.Exp Dermatol，2005，14:315-320.

19 Nakashima S，Matsuyama Y，Nitta A，et al.Highly efficient transfection of human marrow stromal cells by nucleofection.Transplant Proc，2005，37:2290-2292.

20 Aluigi M，Fogli M，Curti A，et al.Nucleofection is an efficient nonviral transfection technique for human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Stem Cells，2006，24:454-461.

21 Kurozumi K，Nakamura K，Tamiya T，et al.Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model.Mol Ther，2005，11:96-104.

22 Nomura T，Honmou O，Harada K，et al.I.v.infusion of brain-derived neurotrophic factor gene-modified human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat.Neuroscience，2005，136:161-169.

23 Vaziri H，Benchimol S.Reconstitution of telomerase activity in norm al human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span.Cur Biol，1998，8:279-282.

24 Bianco P，Robey PG.Marrow stromal stem cells.J Clin Invest，2000，105:1663-1668.

25 樸明學，王忠誠，蒙和，等.轉導hTERT基因致人骨髓基質細胞永生化及向神經元樣細胞誘導分化的研究.中國微侵襲神經外科雜志，2005，1O:313-316.

26 Honma T，Honmou O，Iihoshi S，et al.Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat.Exp Neurol， Exp Neurol.2006;199:56-66.

27 Wang L，Li Y，Chen J，et al.Bone marrow stromal cells of bcl-2 transgenic mice express widespread Bcl-2 protein and reduce apoptosis in a serum-free medium.Abstracts of the International Stroke Conference，2001，32:380.

28 Wei L，Cui L，Snider BJ，et al.Transplantation of embryonic stem cells overexpressing Bcl-2 promotes functional recovery after transient cerebral ischemia.Neurobiology of Disease 2005，19:183-193.

110000 遼寧大學校醫院內科(付霞);中國醫科大學附屬第一醫院神經內科(何志義)