單核細胞增生性李斯特氏菌快速檢測技術研究進展

劉海泉，沈 瀟，吳啟華，潘迎捷，孫曉紅

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.美國緬因大學食品科學與人類營養(yǎng)系，美國 緬因州 04469-5735）

單核細胞增生性李斯特氏菌（LM）簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性、兼性厭氧、嗜冷、過氧化氫酶陽性的桿形細菌，目前李斯特菌屬有6個種，但只有單增李斯特菌（L.monocytogenes）可導致人類患病，為典型的胞內寄生菌。LM廣泛存在于環(huán)境中，據(jù)WHO報道，健康人的糞便中LM攜帶率為0.6%～16%，有70%的人可短期帶菌，但感染LM后引起的李斯特菌病有高達20%～30%的致死率[1]。2002年單增李斯特菌被WHO列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[2]。

目前有各種各樣的快速方法來檢測微生物，有免疫學方法、分子生物學方法、生物化學和酶方法、膜過濾的方法、生物傳感器以及其他方法。國家標準2008版本GB/T4789.30-2008[3]，一方面增加了全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法和全自動病原菌檢測系統(tǒng)篩選法，另一方面由于成熟的商業(yè)化試劑和儀器的使用，至少縮短了2 d的檢測時間。但是由于增菌時間乃需要至少2 d時間，因此有必要開發(fā)完善新的快速檢測方法。

1 生物化學和酶學方法

1.1 快速酶促反應顯色培養(yǎng)基

目前主要應用的有CHROMagar Listeia顯色培養(yǎng)基和3MTM PetrifilmTM測試片。張淑紅等在人工污染樣品和實際樣品檢測中，顯色培養(yǎng)基CHROMagar Listeria和HK Listeria與傳統(tǒng)平板OXA和MMA可以達到相同的檢測限和靈敏度，且具有更高的特異性，可大大提高檢測效率[4]。王殿夫比較了3MTM PetrifilmTM環(huán)境李斯特菌測試片和平板法定量檢測肉制品中的LM。結果表明，3MTM Petri－filmTM環(huán)境李斯特菌測試片法和平板法檢測LM的結果基本一致，適合于肉制品中LM的檢測[5]。

1.2 全自動微生物分析系統(tǒng)

隨著儀器分析技術的進步和計算機的廣泛應用，微生物菌種鑒定逐漸由傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察和人工生理生化實驗鑒定發(fā)展進入了基于儀器自動化分析的鑒定系統(tǒng)階段。由于其操作可實現(xiàn)標準化、而且簡便、快捷、準確率高，已成為微生物檢測發(fā)展的方向之一。現(xiàn)在已有很多全自動微生物分析系統(tǒng)，如VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、SENSITITRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)及 MICROSCAN 系統(tǒng)等[6]。

2 分子生物學方法

2.1 探針雜交

DNA探針法利用同位素、生物素等標記的特定DNA片斷，當DNA探針與待測的非標記單鏈DNA（或RNA）按堿基順序互補結合時，以氫鍵將2條單鏈連接而形成標記DNA-DNA（或標記DNARNA）的雙鏈雜交分子。將未配對結合的核苷酸溶解后用檢測系統(tǒng)（放射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應結果。因此利用該方法可以檢測樣品中是否存在LM，測定放射性或熒光強度可以得出樣品中LM的個數(shù)。Byron F等針對李斯特屬16S核糖體亞單元的特異序列設計了6個熒光標記的肽核酸探針，與整個細胞進行原位熒光雜交[7]。

2.2 PCR（聚合酶鏈式反應）

PCR是近年來應用最廣的分子生物學方法，在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質高度保守的核酸序列設計特異引物進行擴增。張輝等針對hly基因建立的PCR方法，具有較強的特異性[8]。李盛豐等針對iap、prfA毒力基因，設計引物，比較了單個PCR、多重PCR、套式PCR等3種方法[9]。Yi Chen等通過設計多條引物建立了多重PCR方法，該方法能夠檢測李斯特屬細菌、LM的1/2a和4b血清型及LM的I、II和III基因型[10]。Alka Mukhopa dhyay等針對大腸桿菌0157：H7的fliCh7基因和LM的iap基因，研究了能同時檢測這兩種病原菌的多重PCR，其具有專一、快速、敏感的特點[11]。

實時熒光定量PCR技術是迄今為止定量最準確、重現(xiàn)性最好的定量方法，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究、病原體檢測、藥物療效考核等諸多領域。Enrica等通過雙標記的探針和對熔解曲線的分析建立了能同時檢測牛奶中的沙門氏桿菌、LM和大腸桿菌O157的多重實時定量PCR[12]。Justin等針對ssrA基因建立了實時定量PCR，其在食品樣品中的檢測限為（1－5）CFU/25g，利用該方法對 175件食品樣品和31件對照進行檢測并與ISO方法比較，具有99.44%的特異性、96.15%靈敏度和99.03%準確性[13]。

2.3 基因芯片

基因組研究計劃的實施，帶動了生命科學研究的革命，基因芯片就是在多種微生物基因組序列被確定之后出現(xiàn)的一種新興檢測技術。這種技術利用從食品微生物中擴增到的序列標記熒光作為探針，與固定在玻片上的成千上萬已知DNA序列（主要是細菌）進行雜交，結果可以通過直接的熒光掃描或酶學方法進行測定。由于在一個芯片上囊括了眾多的已知菌序列，故可以同時鑒定檢測樣品中的多種細菌。Sergeev等研制了一種能夠檢測4種弧形桿菌屬、6種李斯特菌、16種金黃色葡萄球菌腸毒素和6種產氣莢膜梭菌毒素的DNA芯片，其中LM純培養(yǎng)的檢測限為200 cfu/g[14]。

2.4 依賴核酸序列的擴增檢測（NASBA）

該反應依賴于禽源成髓細胞瘤逆轉錄酶（AMV-RT）、RNaseH和T7 RNA聚合酶，在3種酶的共同作用下，以單鏈RNA為模板進行核酸序列的擴增。Anna Nadal等發(fā)展了分子信標實時NASBA（QNASBA）法檢測和鑒定LM，驗證了hly基因mRNA序列與QNASBA的效率和靈敏度。該方法能檢測到100個目標分子和LM對數(shù)期的40個細胞[15]。

3 免疫學方法

免疫學方法是基于抗體、抗原的反應，只需少許樣品就可以精確檢出抗原，并且不易受基質影響，提供實時信息。目前已有的檢測方法有：酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）、酶聯(lián)熒光分析法（ELFA）、乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術等。

Mattingly等首先于1988年報道了針對LM鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗程序，該法2～3 d內可從自然污染樣品中檢出LM[16]。Kim等設計了與hly基因PCR擴增的132 bp產物雜交的探針，建立的PCR-ELISA法可以在5 h內檢測出10個LM細胞[17]。

Sewell等將 LM 培養(yǎng)增菌至（104～105）cfu/mL 后用自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)（VIDAS）檢測。陽性結果檢出率為97%，假陰性、假陽性結果檢出率為1.9%、3.0%[18]。林濤等采用全自動熒光酶免疫分析儀（mini VIDAS）和國標法相結合，能在48 h內對樣品進行快速篩選[19]。

免疫磁性分離技術是在磁性顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，抗體與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結合，在外加磁場的作用下載有致病菌的磁性顆粒向磁極方向聚集，棄掉樣品混合液，從而使致病菌不斷分離、濃縮。Yang等利用羧基優(yōu)化改良的納米磁珠與兔抗LM抗體共價結合，通過胺基在人為污染的牛奶中有效捕捉目標，并與實時PCR結合，可以檢測到0.5 mL牛奶或營養(yǎng)肉湯樣本中102個細胞[20]。

4 生物傳感器檢測

生物傳感器技術近20 a來有了迅猛的發(fā)展，它能滿足食品中對病原微生物靈敏、實時檢測的要求。Pratik Banerjee等首次使用基于膠原質封裝哺乳動物細胞的細胞傳感器快速檢測病原菌或毒素。把B-雜交瘤細胞、Ped-2E9細胞封裝在I型膠原基質構成的多板生物傳感器，快速檢測致病性李斯特菌活細胞、李斯特溶血素O和蘇云芽孢桿菌腸毒素[21]。

5 討論

食品中病原菌檢測的主要問題之一是時間。目前出現(xiàn)了許多鑒定各種病原菌的快速方法，如PCR技術、基因探針、酶聯(lián)免疫方法等，但大部分還是處于實驗室階段。通常快速鑒定方法是在增菌之后、生化鑒定培養(yǎng)之前進行。這些檢測方法適用于對某種陰性結果進行快速評價。但是在可能性非常低的情況下，某些死細胞會與免疫球蛋白結合，或者死細胞的DNA被擴增，使檢測結果成假陽性。這也是目前PCR方法和免疫學方法需要解決的問題。因此，當出現(xiàn)陽性結果時，對培養(yǎng)物一定要慎重處理，應繼續(xù)進行生化實驗來確認。另外，各種快速檢測方法受到前處理的制約，前處理是目前的瓶頸。做好樣品的前處理，就能夠在實際食品樣品中排除干擾，避免錯誤結果。因此，只有解決好樣品的前處理，快速檢測方法才有可能應用到實踐。

由于LM分布廣，適應能力強，對人類健康威脅大，因此簡單快速、靈敏高效、經濟實用、自動化程度高的檢測技術顯得非常重要。但是目前還沒有一種方法可以同時兼?zhèn)湟陨蟽?yōu)點。由于LM的單克隆抗體制備較困難，具有種特異的抗體一直是免疫學方法要解決的問題。樣品中由于存在死的致病菌、特異性DNA片段，常常造成PCR檢測結果比常規(guī)方法假陽性率增大，陽性率變高。

此外，從GB/T4789.30的08版與03版變化可以看出，新技術和新材料的使用，使得檢測時間大為減少，但仍以“金標準”的常規(guī)培養(yǎng)為主。雖然目前的快速檢測手段還有很多問題需要解決，但隨著新技術和新材料的出現(xiàn)，以及理論研究的深入，一些技術必將在食源性致病微生物檢測和鑒定方面替代經典方法。檢測手段固然重要，但是不能因此忽略預防的重要性。執(zhí)行良好的操作規(guī)范（GMP）和良好衛(wèi)生規(guī)范（GHP），并用HACCP體系管理食品的生產和加工，從源頭上杜絕LM污染，才是避免LM危害的首選。

[1]WHO/FAO.Risk assessment of Listeria monocytogenes in readyto-eat foods：Interpretative Summary[C].Microbiological risk assessment series，2004.

[2]Fact S.Foodborne diseases emerging [EB/OL].http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs124/en/index.html.

[3]劉秀梅，楊 洋，陳偉偉，等.GB/T4789.30-2008單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2009.

[4]張淑紅，吳清平，張菊梅.顯色培養(yǎng)基在單核細胞增生李斯特菌快速檢測中的應用研究 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（1）：43-45.

[5]王殿夫.用3M PetrifilmTM環(huán)境李斯特菌測試片和平板法定量檢測肉制品中的單核細胞增生性李斯特菌的比較實驗 [J].中國釀造，2008，18：78-79.

[6]程 池，楊 梅，李金霞，等.Biolog微生物自動分析系統(tǒng)細菌鑒定操作規(guī)程的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（5）：50-53.

[7]Byron F，Brehm S，Jens J，et al.Design and Evaluation of 16S rRNA Targeted Peptide Nucleic Acid Probes for Whole-Cell Detection of Members of the Genus Listeria[J].Applied and Environmental Microbiology，2005，71，（9）：5451–5457.

[8]張 輝，王興龍.食品中單核細胞增生性李斯特氏菌PCR快速檢測[J].食品科學，2008，29（4）：324-327.

[9]李盛豐，趙 姣，鐘名華，等.單增李斯特菌不同PCR快速檢測方法比較[J].中國公共衛(wèi)生，2008，24（8）：1021-1023.

[10]Yi C，Stephen J K.Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Bacteria of the Genus Listeria，Listeria monocytogenes，and Major Serotypes and Epidemic Clones of L.monocytogenes[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73 （19）：6299-6304.

[11]Alka M，Utpal K M.Novel multiplex PCR approaches for the simultaneous detection of human pathogens：Escherichia coli 0157：H7 and Listeria monocytogenes [J].Journal of Microbiological Methods，2007，68：193-200.

[12]Omiccioli E,Amagliani G,Brandi G，et al.A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp.，Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk[J].Food Microbiology，2009，26：615-622.

[13]Justin O G，Margaret R，Sara S B，et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes in food using culture enrichment combined with real-time PCR[J].Food Microbiology ，2009，26：4-7.

[14]Sergeev N，Distler M，Courtney S，et al.Multipathogen oligonucleotide microarray for environmental and biodefense applications[J].Biosens Bioelectron，2004，20（4）：684-698.

[15]Anna N，Anna C，Nigel C，et al.A molecular beacon-based real time NASBA assay for detection of Listeria monocytogenes in food products：Role of target mRNA secondary structure on NASBA design[J].Journal of Microbiological Methods，2007，68：623-632.

[16]Mattingly J A，Butman B T，Plank M C，et al.Rapid monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Listeria in food products[J].J Assoc Off Anal Chem，1988，71（3）：679-681.

[17]Kim H J，Jae C C.Rapid and Sensitive Detection of Listeria monocytogenes Using a PCR-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay[J].J.Microbiol.Biotechnol，2008，18（11）：1858-1861.

[18]Sewell A M，Warburton D W，Boville A.The development of an efficient and rapid enzyme linked fluorescent assay method for the detection of Listeria spp from foods[J].Int J Food Microbiol，2003，81：123-129.

[19]林 濤，劉真真，楊雪嬌，等.全自動熒光酶免疫分析儀-國標法檢測水產品中單核細胞增生李斯特氏菌的研究 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（4）：655-656.

[20]Yang H.，Qu L.，Wimbrow，et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes by nanoparticle-based immunomagnetic separation and real-time PCR[J].International Journal of Food Microbiology，2007，118：132-138.

[21]Pratik B，Dominik L，Joseph P R，et al.A novel and simple cell-based detection system with a collagen-encapsulated B-lymphocyte cell line as a biosensor for rapid detection of pathogens and toxins[J].Laboratory Investigation 2008，88：196-206.