關于微生物分子生物學的研究

沈陽師范大學化學與生命科學學院 孫增明

關于微生物分子生物學的研究

沈陽師范大學化學與生命科學學院 孫增明

一、微生物簡介

微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行。人類疾病中有50%是由病毒引起。世界衛生組織公布資料顯示：傳染病的發病率和病死率在所有疾病中占據第一位。在疾病的預防和治療方面，人類取得了長足的進展，但是新現和再現的微生物感染還是不斷發生，大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療藥物,一些疾病的致病機制并不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力，使許多菌株發生變異，導致耐藥性的產生，使人類健康受到新的威脅。一些分節段的病毒之間可以通過重組或重配發生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導致感染的株型發生了變異，這種快速的變異給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。而耐藥性結核桿菌的出現使原本已近被控制住的結核感染又在世界范圍內猖獗起來。

微生物千姿百態，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結構發生不良變化。當然，有些微生物是有益的，它們可用來生產如奶酪、面包、泡菜、啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過顯微鏡放大約1 000 倍才能看到。比如中等大小的細菌，1 000個疊加在一起只有句號那么大。想象一下一滴牛奶，每毫升腐敗的牛奶中約有5千萬個細菌，或者講每夸脫牛奶中細菌總數約為50億。也就是一滴牛奶中可能含有50 億個細菌。

微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青霉菌抑制其他細菌的生長中發現了青霉素，這對醫藥界來講是一個劃時代的發現。后來大量的抗生素從放線菌等的代謝產物中被篩選出來。抗生素的使用在第二次世界大戰中挽救了無數人的生命。一些微生物被廣泛應用于工業發酵，生產乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，并且可再生潛力極大，稱為環保微生物；在極端環境例如高溫、低溫、高鹽、高堿以及高輻射等普通生命體不能生存的環境，依然存在著一部分微生物等等。看上去，已經發現的微生物已經很多，但實際上由于培養方式等技術手段的限制，人類現今發現的微生物還只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

二.現代環境分子生物學研究方法

對環境微生物進行分子生物學研究的方法主要有同源性分析法、梯度凝膠電泳方法、PCR技術和核酸分子雜交技術等。

1. 16S rRNA同源性分析法。核蛋白體RNA(ribosomalRNA)是細胞內含量最多的RNA，約占RNA總量的80%以上，在蛋白質翻譯中起著重要的作用。rRNA基因同源分析方法是目前研究的熱點，是多種分子生物學技術的組合，它通過對微生物的rRNA進行分析，揭示微生物的多樣性，是分子微生物生態學的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括環境樣品的總DNA提取、探針及引物的設計、PCR擴增、DGGE、TGGE、基因文庫的篩選、序列測定及分析、系統樹的構建和原位雜交等技術。PCR擴增是分子生態研究的基礎和關鍵步驟，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環，可以在界、門、綱、目、科、屬甚至在種的水平上設計特異性引物，該引物核苷酸序列應與待擴增的微生物類群的rRNA全部匹配，但與其他類群的rRNA有錯配或盡可能少。

2. 梯度電泳技術。DGGE技術通過指紋圖譜直接再現群落結構，避免了分離純化培養所造成的分析上的誤差，因此成為研究微生態的強有力工具。DGGE用于分析確定環境中微生物群體的遺傳多樣性、環境中微生物變化的動態監測和微生物菌株的篩選，可避免對多個無遺傳差別或差別很小的菌株進行繁瑣的各種表觀特征研究，近十年已被廣泛應用于各種環境微生態研究中。

3. PCR擴增技術。PCR技術在結合其他技術如競爭PCR、RAPD、AFLP、RFLP等的基礎上可對被擴增序列作定性或定量分析，用于研究微生物群體結構。

PCR-RFLP是將PCR技術和RFLP技術結合用于檢測PCR降解基因在環境中的存在情況，當將不同種細菌的DNA經多種限制性內切酶進行酶切時，內切酶在其上的識別位點的數目和距離會發生改變，產生相當多大小不等的DNA片段，在進行凝膠電泳時，由于遷移率不同形成不同的帶，因此可通過對酶切產物的分析，探測該基因的多態性，從而得到不同污染地區降解某物質的微生物群落生物多樣性。

4. 核酸分子雜交技術。核酸分子雜交技術是20世紀70年代發展起來的一種嶄新的分子生物學技術，是利用一段已知序列并帶有放射性同位素32P等標記的多聚核苷酸作探針，檢測復雜的核酸分子混合物中是否存在與之互補目標序列的技術。印跡轉移雜交是用放射性同位素探針與濾膜上的DNA或RNA分子雜交，經顯影曝光顯示印跡。印跡轉移雜交分成兩種，一種是Southern印跡雜交，用于檢測DNA樣品；另一種是Northern印跡雜交，用于檢測RNA樣品。原位雜交法是將標記的探針（如熒光標記探針）加在組織切片（包括染色體）上，進行顯微照相檢測目標基因或目標序列在染色體上的位置。在核酸原位雜交技術中，熒光原位雜交應用較為廣泛。

分子生物學的發展揭示了生命本質的高度有序性和一致性，是人類在認識論上的重大飛躍。現代分子生物學研究手段對于深入開展微生物生態學研究具有日益重要的意義。同源性分析法、梯度凝膠電泳方法、PCR技術和核酸分子雜交技術作為代表性分子生物學分析方法，各有其優缺點，但在未來現代微生物研究過程必將發揮越來越重要的作用。