乙酰肝素酶與糖尿病性腎病的相關性研究進展

熊琪輝（綜述），甘華俠（審校）

（南昌大學a.研究生院醫學部2009級；b.第一附屬醫院內分泌科，南昌 330006）

糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者的重要死因，同時又是導致腎功能衰竭的一個重要疾病。早期診斷DN，有利于提高糖尿病患者的生存率、生活質量，減少國家的醫療負擔。目前尚缺乏更優于尿微量白蛋白的檢測指標，以更早的發現潛在的DN人群，早期對其進行干預，改變DN的發展及預后。

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）為廣泛存在于脊椎動物和無脊椎生物組織細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）和細胞表面的生物大分子，并且是腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的主要構成成分。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是一種葡萄糖醛酸內切酶，通過特異性降解釋放出多種與HS結合的活性因子［堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板源性生長因子、白介素－2、肝素輔助因子Ⅱ等］，參與許多病理和生理過程。正常生理條件下，其基因表達和酶活性受到多種因素調控，否則其過度表達會促進諸多病理過程發生，如：腫瘤浸潤轉移、血管形成、炎癥和自身免疫反應等。

筆者就近年來國內外關于HPA與DN之間相關性的研究進行綜述，以求進一步明確二者之間可能存在的關聯。

1 HPA概述

1.1 HPA的發現

M.H??k等［1］于1975年在鼠肝臟組織中發現一種降解HS側鏈的內切糖苷酶，這是首次對于HPA存在的報道。但由于該酶的含量低、性質不穩定，并缺乏一種高效的檢測方法，HPA蛋白的分離純化研究遇到了重重困難。直到90年代后期，澳大利亞C.Freeman等［2］才成功建立了一個能夠快速定量檢測 HPA的方法。隨后I.Vlodavsky等［3－4］的實驗室又分別獨立完成了HPA cDNA的基因克隆，推動了當今對HPA的進一步研究。

1.2 HPA的基因定位與結構

HPA基因的單核苷酸全長序列已經明確。該基因定位于4號染色體q21.3上，從起始密碼子到終止密碼子全長為40kb，含有12個外顯子和11個內含子。啟動子位于AUG上游2.3kb處，全長1 758bp，含有可編碼543個氨基酸多肽的開放閱讀框，相對分子質量為61 192，與從血小板中純化的蛋白質分子質量相近。N末端有親水側鏈，17和35區有降解位點，110－170處有親水基團，另外有6個N末端糖基位點。SDS－PAGE分析［5］證實純化的HPA活性酶是由50kU亞基和8kU亞基非共價連接而成的異二聚體；有研究［6］證實，HPA前體酶必須經過蛋白酶解加工過程才可獲得二聚體活性。

1.3 HPA的生物學功能及其調節

HPA為β葡萄糖苷酸內切酶，可以切斷細胞表面和ECM中乙酰硫酸肝素鹽蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）上的 HS，產生如下生物學效應：1）HSPGs水解，使ECM和GBM穩定結構破壞、細胞間質屏障功能降低；2）釋放結合在HS上的bFGF，通過促進細胞分裂、趨化、微血管形成、膠原纖維降解等多方面作用，加快創面愈合及促進腫瘤的生長和轉移，恢復凋亡細胞活力；3）釋放結合在乙酰肝素上的尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織纖溶酶原激活物（tPA），溶解基質網狀結構；4）uPA和tPA還可通過活化表皮生長因子（epidermal growth factor，ECF），激活ECM中的蛋白質酶聯反應，使膜的功能降低，屏障功能減退；5）誘發T細胞介導的遲發性超敏反應和自身免疫反應；6）激活酯酶增強脂質代謝。該酶廣泛存在于細胞膜和ECM中，并保持穩定水平，以調節乙酰肝素生成和降解平衡，維持機體組織細胞正常的增殖、分化、黏附和遷移。

HPA的活性作用受神經生長因子（NGF）、乙酰肝素相關蛋白和富含組氨酸蛋白肝素類似物的影響。D.Marchetti等［7］在研究黑素瘤的神經營養調節、侵襲過程的實驗中發現，NGF和神經營養因子23（NT23）能夠提高HPA的活性，因為它們能夠與神經營養因子受體p75NTR結合。然而不能與神經營養因子受體p75NTR結合的NGF突變體和非神經生長因子不能提高黑色素瘤細胞的侵襲力。另外還檢測了在合成的HSPGs存在情況下RL95細胞HPA的活性，證實乙酰肝素鹽相關蛋白和HPA對HS特異性識別有共同的機制，它們依賴HS的活性可能相互調節。

2 HPA與蛋白尿性腎小球疾病

腎小球濾過屏障是腎小球的重要結構，由內皮細胞、GBM、足細胞及其裂孔隔膜三層結構所構成，濾過屏障的完整性在阻止蛋白質漏出中起關鍵作用。HSPGs是一類大分子蛋白聚糖類化合物，由核心蛋白、HS側鏈、葡胺聚糖側鏈共價相連，是GBM的重要組成成分，HS側鏈上硫酸根和羧基對GBM陰離子電荷起重要作用。HS一方面富含豐富的負電荷，可限制帶負電的血漿白蛋白通過，另一方面可與GBM中的膠原和層粘連蛋白相互作用維持GBM分子結構的完整性。

一般認為，HPA是哺乳動物中唯一可以選擇性降解HS側鏈的糖苷內切酶，在脾臟、淋巴結等免疫組織中均可檢測到，而在其他正常組織中，如腎臟、心臟等不表達或低表達。M.J.van den Hoven等［8］報道，HPA在人腎小球毛細血管內皮細胞表達極少，其中在皮質髓質的小管上皮細胞的表達相對較高。同時V.Levidiotis等［9］近來也報道HPA在正常大鼠腎臟的腎小球不表達，在小管上皮細胞呈低表達。但是病理狀態下腎臟HPA的表達增高（主要是腎小球HPA的表達增加），從側面證明了機體內正常水平HPA含量對于維持腎小球正常生理功能的重要性。

HPA通過裂解HS側鏈，破壞HSPGs完整性可導致GBM選擇通透性改變及腎小球上皮細胞和內皮細胞錨連位點的喪失。此外，HPA不僅能夠降解HS側鏈，還使與HS結合的一系列生長因子釋放出來，產生相應的繼發反應可能參與了在各種蛋白尿性腎小球疾病（糖尿病性腎病［10－11］、動物模型的膜性腎病［12］、藥物所致腎病［9，13］、抗基底膜抗體疾病［14］、兒童激素敏感性腎病綜合征［15］、局灶節段性腎小球硬化性腎病、IgA腎病、微小病變性腎病［16］、淀粉樣變性病［17］）的病理生理過程。

但存在爭議的是，最近有一部分研究顯示HPA可能與腎小球性蛋白尿的發生發展并不存在明確的關聯。T.J.Wijnhoven等［18］研究表明，不論伴有或不伴有蛋白尿的成年人和兒童腎臟病患者的腎臟HS主鏈表達沒有異常。J.van den Bom等［19］研究表明，尿白蛋白排泄率增加可能與腎小球HS的表達和結構的改變沒有明確的關聯。更有研究［20］提出新的觀點，認為HS保持GBM處于一個“開放狀態”，促進蛋白通過腎小球毛細血管壁。研究人員給小鼠靜脈應用神經氨酸苷酶（可水解GBM神經氨酸）后導致小鼠產生白蛋白尿，再加用肝素酶Ⅲ后，電鏡下發現HS消失，同時尿中蛋白減少。

3 HPA與DN的相關性

我國DN是導致終末期腎病的第二位原因。DN導致蛋白尿形成的機制有：腎小球內毛細血管跨膜壓力過高；腎小球濾過屏障功能障礙，包括濾孔改變和電荷改變；腎小球上皮細胞代謝障礙等。近年來，人們對DN分子發病機制的認識不斷深入，血流動力學紊亂/內皮細胞受損固然是DN蛋白尿的始發因素，但內皮細胞之間的窗孔較大，在正常情況下即能讓白蛋白自由通過，GBM則成為真正防止蛋白質漏出的第一道屏障。

近年來有許多的證據表明，HPA參與了DN的發生發展。J.B.Maxhimer等［11］研究表明，在DN的病理狀態下，可能由于內環境中高水平葡萄糖含量的影響可誘導HPA的表達增加和基底膜上HS的表達減少。在體外高糖環境中培養腎臟上皮細胞發現HPA mRNA的表達上調，HPA抑制劑能夠保護細胞表面HS的表達。又有進一步的研究［10，21］觀察到，在臨床蛋白尿和微量白蛋白尿的糖尿病患者中HPA的活性是增加的，相對正常人的尿液中未能檢測到HPA的活性。唐琳等［22］進行的研究表明，DN患者腎組織中HPA表達升高，并且與尿蛋白量呈正相關，提示HPA可能參與了DN蛋白尿的發生。

有研究［23］測定證實糖尿病患者血液、尿液中HPA的水平是增高的。DN患者比不并存糖尿病并發癥者血液、尿液中HPA水平增高更加明顯，DH患者中的血HPA水平的增高，會進一步導致整個機體中HPA水平的升高，從而影響到其他的器官、組織和細胞。而接受腎移植后的DN患者尿液中HPA的水平降低，說明了HPA可能主要來源于糖尿病相關的腎功能衰竭。事實上，免疫組織化學研究分析表明，HPA表達于腎小管上皮細胞，在正常腎臟的腎小球中不表達；但是在DN的腎小球和腎小管上皮細胞其表達上調［11］。值得注意的是，在糖尿病腎移植患者，除了糖尿病相關的藥物，還需要應用的免疫抑制藥物可能會影響乙酰肝素酶的分泌。

4 結語

DN是糖尿病的重要并發癥，是一種蛋白尿性腎小球疾病，HPA可通過水解腎小球GBM的重要組成成分HSPGs，導致GBM電荷屏障破壞而在蛋白尿的發生、發展中起到一定作用。多項研究證明，DN患者機體中HPA水平的變化參與了DN的病理生理過程。能否通過檢測HPA早期診斷DN，及通過抑制HPA的表達是否有助于防治DN的發生發展有待于進一步的研究。

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