兔激素性股骨頭缺血性壞死模型 BMSCs超微結構觀察

鞏 凡，張 焱，白志剛，牛東生*

(1寧夏醫科大學，銀川 750004;2寧夏回族自治區人民醫院)

激素性股骨頭缺血性壞死(SANFH)是因為大量應用皮質類固醇類激素，造成股骨頭內骨細胞、血管內皮細胞等死亡或凋亡所引起的病理過程。骨髓間充質干細胞 (BMSCs)是一種主要存在于骨髓中，具有多向分化能力的干細胞。2010年 3月，我們觀察了兔 SANFH模型的 BMSCs的超微結構，探討SANFH的成因及對骨修復的影響機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年新西蘭大白兔 10只(體質量2.5～3.0 kg，由寧夏醫科大學動物試驗中心提供);馬血清(鄭州益康生物工程有限公司);醋酸潑尼松龍(25 mg/ml，中國浙江仙據制藥股份有限公司);青霉素鈉:0.48 g(80萬 U，石藥集團中諾藥業有限公司);Percoll細胞分離液(Pharmacia 1.073 g/ml);L-DMEM(Gibco公司);PBS(Sigma公司 );肝素鈉注射液(12 500 U/2 ml，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 參考相關文獻[1]，10只健康的成年新西蘭大白兔分籠喂養，適應性飼養 3 d后每只經耳緣靜脈注射馬血清 10 ml/kg 1次，間隔兩周后再注射 1次。繼續喂養兩周后肌肉注射醋酸潑尼松龍 8 mg/kg，間隔 1 d注射 1次，共 5次。繼續喂養 3～5周后行 X線檢查，觀察結果。結果發現骨小梁中出現大量空骨陷窩及核固縮現象，符合激素性股骨頭缺血性壞死的病理學定義[2，3]，說明制模成功。為預防感染，所有試驗動物每周給予肌肉注射青霉素鈉 20萬 U/只。

1.2.2 細胞分離及超微結構觀察 予制模前及制模后 2個月行骨髓細胞分離:將新西蘭大白兔俯臥位固定于手術臺上，3%戊巴比妥鈉 1 ml/kg(30 mg/kg)耳緣靜脈緩慢注射麻醉，備皮，碘伏消毒皮膚。選取股骨近端外側將 F16骨髓穿刺針定位，待骨髓穿刺針有明顯落空感時，抽出穿刺針內芯，于穿刺針尾部接入 10 ml注射器(內含 12 500 U肝素 1 ml)負壓抽吸，每次穿刺抽取 5 ml骨髓液。抽取的骨髓立刻進入無菌間，與等體積的不含血清的 L-DMEM培養基混勻，500 r/min離心 5 min，棄上清液，用 5.0 ml不含血清的 L-DMEM培養基混勻，緩慢加入預先加有 5.0 ml密度為 1.073 g/ml的 Percoll分離液的離心管內，使其位于 Percoll分離液的液面上，靜置 5 min，1 500 r/min離心 30 min。可見管內液體分為四層，最上層約占液柱的 1/2，為紅色的培養液層，第三層約占液柱的 1/2，為乳白色的 Percoll分離液層，兩層交界處為高約 1.0 mm的灰白色云霧狀層，為單個核細胞層，底層緊貼試管壁，為一薄層紅色細胞層，為紅細胞等。小心吸去最上層的紅色培養液，緩慢加入 2%戊二醛固定 2 h(4℃)，待灰白色云霧層固定成塊后，小心將固定塊挑出，放入小瓶中，4℃、2%戊二醛繼續固定 30 min，換 0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗 3次，0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液保存(4℃)。1%鋨酸浸泡染色 2 h(4℃)。梯度乙醇脫水。環氧丙烷滲透 2次。完全樹脂包埋后入模具。修整模塊，切片，定位，超薄切片，于電鏡下觀察細胞超微結構變化。

2 結果

制模前 BMSCs:低倍下見少量紅細胞及兩個并排的 BMSCs，細胞核較大核膜完整;細胞質豐富，電子密度均一，細胞器結構清晰。并可見另一 BMSCs，細胞質濃縮聚集，核膜不完整;細胞質電子密度增高，其間細胞器結構不清。高倍下見雙層核膜完整，細胞核較大，染色質分布均勻，核內染色質豐富，核孔較多;細胞質豐富，電子密度均一，細胞器豐富，線粒體、內質網等細胞器結構清晰。制模后 BMSCs:低倍下見少量紅細胞及一個淋巴細胞。其中可見兩個細胞出現染色質濃縮、聚集并出現凋亡小體。高倍下見胞體變小，胞質基質密度增加。細胞核不完整，核膜模糊，染色質固縮、凝集;細胞質濃縮，電子密度增高，胞質內見大小不等的空泡及大量脂滴，細胞器結構不清。

3 討論

BMSCs能夠分化為多種組織細胞，包括骨、軟骨、脂肪、肌腱細胞等。關于激素性股骨頭缺血性壞死的致病原因，目前尚有爭議，其中以骨質疏松、血液高凝狀態、血管內凝血、脂肪代謝紊亂、骨內高壓等較為普遍。激素性股骨頭缺血性壞死的致病過程極其復雜[2]，上述原因并不是孤立存在，而是相互聯系。其中脂肪代謝紊亂學說認為與激素導致骨髓內脂肪細胞聚集、肥大有關[3]。研究發現，動物應用激素后股骨頭內脂肪細胞肥大，并見大的脂肪滴形成;而脂肪滴旁發現的間充質干細胞普遍出現功能障礙的特征:①胞質內空泡形成:可能是線粒體和內質網腫脹所致，說明細胞有氧呼吸及蛋白合成可能受到干擾;②自噬體出現:提示細胞出現衰老;③胞質內大量脂滴出現:說明細胞的脂類代謝功能可能受到影響。本研究結果顯示，應用激素前只有少量 BMSCs出現了凋亡，此與成年動物細胞正常衰老有關。應用激素后大量的 BMSCs出現凋亡或細胞器受損，胞質中看到空泡和大量脂滴形成，提示激素可能通過影響細胞的正常脂類代謝使其過早出現功能異常，并可能引發其啟動凋亡程序，此進一步印證了 Wang等[4]的研究，他們發現大量使用糖皮質激素可以使BMSCs減少;其在對成骨細胞的觀察中胞質內沒有發現脂滴，僅看到腫脹的線粒體及自噬體，證明有氧呼吸被干擾沒有引起脂類代謝紊亂。

本研究中采用 Percoll細胞分離液分離 BMSCs后不經培養，直接固定，減少了細胞培養對細胞狀態的影響及各種人工培養液對細胞器的損害，觀察到的細胞狀態更符合其體內狀態，結果與喬東訪等[5]體外培養的兔 BMSCs觀察結果一致。

本研究發現，激素導致股骨頭缺血壞死的可能機制為通過對血液系統的干擾，影響股骨頭內各種細胞的有氧呼吸;又通過干擾 BMSCs的脂類代謝影響骨的修復，最終導致股骨頭壞死塌陷。

[1]李子榮，張念非，岳德波，等.激素性股骨頭壞死動物模型的誘導和觀察[J].中華外科雜志，1995，33(8):485-487.

[2]Mont MA，Jones LC，Elias JJ，et al.Strut-autograft with and without osteogenic protein-l:a primary study of a canine of femoral head defect model[J].J Bone Joint Surg Am，2001，83(7):1013-1022.

[3]Wang GJ，Lennox DW，Rteven SL，et al.Cortisone-in-duced intra femoral head pressure change and its response to a drilling decompression method[J].Clip Ortho Relat Res，1981，(159):274-278.

[4]Wang BL，Sun W，Shi ZC，et al.Decreased proliferation of mesenchymal stem cells in corticosteroid-induced osteonecrosis of femoral head[J].Orthopedics，2008，31(5):444.

[5]喬東訪，路艷蒙，傅文玉，等.體外培養兔骨髓間充質干細胞的超微結構觀察[J].電子顯微學報，2002，21(5):491-492.