鈣結合蛋白 S100A8和 S100A9的異源二聚體體外構建

秦鳳金，段曉華，殷紅梅，盛 梅，丁雪濤

(勝利油田中心醫院，山東東營 257000)

S100A8和 S100A9是鈣結合蛋白 S100家族的兩個成員，最早發現由中性粒細胞、單核巨噬細胞等表達，具有化學趨化作用，參與炎癥反應過程，是多種炎性疾病的標志物[1]。最近研究表明 S100A8和S100A9可以促進多種腫瘤細胞的凋亡，與乳腺癌、結腸癌、食管癌等腫瘤的發生、轉移有關[2]，但目前對其發揮誘導凋亡作用的機制尚不明確。2006～2007年，我們于體外構建了 S100A8和 S100A9蛋白的異源二聚體(S100A8/S100A9)，旨在進一步從細胞水平研究其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 基因 S100A8和 S100A9的原核表達載體 pET28a-S100A8和 pET28a-S100A9由加拿大LAVAL大學醫學部感染性疾病研究中心饋贈，高純度質粒提取試劑盒購自德國 Qiagen公司，抗S100A8抗體 Calgranulin B(C-19)、抗 S100A9抗體Calgranulin A(C-19)及抗 S100A8/S100A9抗體Calgranulin A/B(27E10)均購自 Santa Cruz Biotechnology公司，Ni-NTA His Bind Resin購自德國 Novagen公司，IPTG購自美國 Sigma公司，BL21購自北京 TIANGEN公司。

1.2 S100A8/S100A9構建

1.2.1 S100A8和 S100A9蛋白的誘導表達 將原核表達載體 pET28a-S100A8和 p ET28a-S100A9分別轉化入表達菌 BL21，培養過夜，挑取分隔良好的單個菌落，用 5 ml LB細菌培養基，加入卡那霉素(終質量濃度 50μg/ml)，37℃空氣浴搖床震搖過夜。第 2天取新搖菌管，加入含同樣抗生素的 LB培養基 50 ml，將過夜培養的菌液 1∶20稀釋，37℃空氣搖床震搖培養 2～3 h(220 r/min)，細菌達到對數生長期(菌液 OD600=0.6～0.8)時開始用 1 mM IPTG誘導，分成三部分，分別于 16、30、37℃空氣浴搖床震搖，優化最佳培養條件。按照最佳培養條件(16℃，誘導培養 16 h)，大規模誘導細菌表達后，取1 ml菌液，4 ℃、4 000 r/min離心 10 min，棄上清 ，40 μl預冷的細菌裂解液重懸，超聲裂解，于 0℃、12 000 r/min離心 30 s，取上清 40μl加入 40μl 2×SDS加樣緩沖液，沉淀部分加入1×SDS加樣緩沖液40μl，100℃煮沸 10 min。分別取 20μl進行 SDSPAGE電泳分析目的蛋白，鑒定蛋白是否以可溶形式表達。

1.2.2 S100A8和 S100A9蛋白純化 收集菌體，加入裂解緩沖液，在冰浴中超聲裂菌，收集菌液，4℃，12 000 r/min離心 20 min取上清液，經 His親和層析柱純化，最后一次洗脫前加入 10 U Thrombin，收集流出液并進行 SDS-PAGE電泳及 Western blot鑒定。將 100μl p-Aminobenzamidingagarose試劑加入純化的 S100A8和 S100A9中，旋轉反應 20 min后離心，去除 thrombin，已純化蛋白透析分裝后冷凍干燥，放于 -80℃冰箱保存。

1.2.3 S100A8/S100A9鑒定 用含 1.3 mM鈣離子的 Hanks-Hepes液溶解蛋白，BCA法蛋白定量后，取等量的 S100A8、S100A9蛋白混合，室溫放置 30 min，分別加入還原及非還原型 5×loading buffer，經SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色，將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，依次滴加羊抗 S100A8/S100A9異源二聚體抗體及其 HRP標記的兔抗羊抗體，采用發光蛋白免疫印跡法進行 Western blot顯示分析。

2 結果

SDS-PAGE分析示 S100A8和 S100A9蛋白在相對分子質量分別約 17 kD和 14 kD處出現明顯的特異條帶，而未經誘導的菌體則無此條帶出現，證明確實為目的蛋白帶。部分誘導蛋白存在于上清中，以可溶形式在大腸桿菌中表達。Ni-NTA-His親和層析純化蛋白，得到純度較高的目的蛋白。經 SDSPAGE電泳及考馬斯亮蘭染色檢測到非還原電泳條件下特異的 S100A8/S100A9的條帶，說明 S100A8/S100A9構建成功。

3 討論

S100蛋白家族是鈣結合蛋白家族中最大的亞類，能夠與鈣離子結合，通過鈣離子信號轉導途徑，在細胞增殖、分化及細胞凋亡中發揮重要生物學作用。近幾年來關于 S100家族成員異常表達與腫瘤關系報道較多，隨著研究深入，發現 S100家族的多個成員與多種腫瘤的惡性增殖、分化、浸潤和轉移密切相關[3，4]，而且 21個成員中有 15個成員均位于人染色人體 1q21區，該區段穩定性差，可發生多種形式的染色體重排，與腫瘤的發生關系密切。S100A8/A9又名鈣衛蛋白，在炎癥中表達上調，有作為趨化靶點的作用。目前關于炎癥與腫瘤發生間的關系逐漸受到關注，S100A8/S100A9既是一種炎性介質，在腫瘤中又有促進癌細胞凋亡的作用。我們的前期實驗亦證明兩者在宮頸鱗癌組織中表達下調[5]。體外形成其異源二聚體對進一步研究其功能及其對腫瘤細胞生物學行為的影響具有重要意義。

根據文獻報道[6]，大腸桿菌表達系統表達純化S100A8和 S100A9蛋白，且兩個蛋白均以可溶形式在大腸桿菌表達，本研究于天然條件下純化得到了目的蛋白，保持了蛋白的生物活性，并成功構建了S100A8/S100A9。由于 S100A8/S100A9的相對分子質量與 S100A9/A9同源二聚體的相對分子質量接近，因此僅從 SDS-PAGE電泳無法明確該條帶是否為 S100A8/S100A9。為進一步鑒定明確，我們采用蛋白免疫印跡法用抗 S100A8/S100A9的抗體孵育。結果示異源二聚體抗體對同源二聚體不能識別，因此 S100A8/S100A9抗體檢測到的在相對分子質量 27 kD處出現的特異條帶應為 S100A8/S100A9，說明 S100A8和 S100A9經上述處理后，可形成異源二聚體。為下一步研究 S100A8/S100A9的生物學功能奠定了基礎。

[1]Stríz I，Trebichavsk I.Calprotectin-a pleiotropic molecule in acute and chronic inflammation[J].Physiol Res，2004，53(3):245-253.

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[3]Massi D，Landriscina M，Piscazzi A，et al.S100A13 is a new angiogenic marker in human melanoma[J].Mod Pathol，2010，23(6):804-813.

[4]West NR，Watson PH.S100A7(psoriasin)is induced by the proinflammatory cytokines oncostatin-M and interleukin-6 in human breast cancer[J].Oncogene，2010，29(14):2083-2092.

[5]秦鳳金，耿力，趙玲，等.S100A9在宮頸鱗狀細胞癌中的表達[J].中國腫瘤臨床，2007，34(12):661-663.

[6]Ryckman C，Vandal K，Rouleau P，et al.Proinflammatory activities of S100:proteins S100A8，S100A9，and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and adhesion[J].J Immunol，2003，170(6):3233-3242.