糖尿病胃動力障礙大鼠胃竇平滑肌組織中CNP和NPR-B蛋白含量變化

蔡英蘭，樸麗花，張默函，姜京植，金 政

(延邊大學基礎醫學院，吉林 延吉 133002)

糖尿病患者普遍存在胃腸功能紊亂，報道約75%的糖尿病患者有胃腸道癥狀，如腹脹、上腹不適、便秘等［1］，導致降糖藥吸收遲滯，血糖控制不良，還可能引起低血糖等。但糖尿病致胃腸動力紊亂的機理仍不完全清楚。胃腸道中存在鈉尿肽(NP)—鈉尿肽受體(NPR)-B/pGC-cGMP和 NO-sGC-cGMP兩種信號轉導途徑［2］，均參與胃腸動力調節。研究表明，胃腸道內 NP及NPR對豚鼠、大鼠和人胃平滑肌自發性運動均發揮抑制性調節作用［3，4］。本研究組前期研究證明，糖尿病胃動力障礙大鼠C型鈉尿肽(CNP)抑制胃竇平滑肌收縮的作用明顯增強［5］。我們于2009年12月～2010年5月進行本研究，擬繼續探討糖尿病胃動力障礙大鼠胃竇平滑肌對CNP敏感性增強的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雌雄不限，體質量220～250 g，由延邊大學實驗管理科動物實驗中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma);CNP、NPR-B抗體(Santa Cruz);RM-6240多道生理信號記錄系統(中國成都儀器廠);TD-2000型真彩病理細胞顯微分析系統(北京天地百年科技有限責任公司)。

1.2 動物模型的制備 Wistar大鼠禁食12 h，自由飲水，腹腔注射STZ(65 mg/kg)制備糖尿病動物模型。正常對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模成功后大鼠均單籠飼養4周，自由進食、飲水。將大鼠擊頭致昏，沿中線剖腹取全胃，放入4℃氧飽和的 Kerb’s液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.75 mmol/L、CaCl22.54 mmol/L、KH2PO41.19 mmol/L、MgSO41.19 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，充以95%O2和5%CO2的混合氣體，pH 7.2～7.4)中，沿胃小彎側剪開，漂洗出胃內容物。小心剪去黏膜層，在距幽門近口端5 mm處沿胃竇環行肌纖維走行方向剪取2 mm×12 mm的環行肌條。取下的肌條放置于Kerb’s液垂直灌流槽中，其一端固定在鉑絲鉤上，另一端與張力換能器相連，灌流槽內溫度維持在37℃，并持續供給95%O2和5%CO2的混合氣體。每次實驗時均給予1 g前負荷，在氧飽和的Kerb’s液灌流槽中孵育40 min，待肌條自發性收縮穩定后，通過RM-6240多道生理信號記錄系統同時記錄正常對照組和糖尿病組大鼠胃竇平滑肌收縮活動、肌條收縮運動的振幅和頻率。將收縮頻率明顯慢于正常的大鼠列入糖尿病胃動力障礙大鼠模型。

1.3 免疫組織化學方法 取胃竇部組織用4%甲醛緩沖液固定24 h。常規方法進行免疫組化實驗。兔CNP抗體1∶600稀釋，NPR-B抗體1∶600稀釋。觀察正常對照組及糖尿病組大鼠胃竇組織中CNP的分布。選取部分胃組織切片作為陰性對照(用PBS替代兔CNP抗體)，與其他切片在同一條件下進行染色。

1.4 實驗結果判定 兩組隨機抽取3張切片，每張切片隨機取3個視野，按胃竇平滑肌CNP及NPR-B顯色程度分弱、中、強3種，分別計1、2、3分，用TD-2000醫用真彩色圖像分析軟件計算相應范圍，將顯色程度和范圍換算成顯色指數。顯色指數=顯色程度×顯色范圍。

2 結果

2.1 胃竇平滑肌CNP分布 正常對照組及糖尿病組大鼠胃竇組織均有CNP蛋白陽性表達，即可見棕色顆粒，主要見于肌層。正常對照組CNP蛋白顯色指數為(41.26±0.71)%，糖尿病組為(41.71±0.21)%，兩者CNP蛋白顯色指數比較無統計學差異(P ＞0.05)。

2.2 胃竇平滑肌NPR-B的分布 正常對照組胃竇平滑肌細胞NPR-B呈陽性，可觀察到散在分布的棕色顆粒，NPR-B蛋白顯色指數為(17.63±1.49)%;糖尿病組胃竇平滑肌細胞NPR-B也呈陽性，但與正常對照組相比呈陽性的棕色顆粒明顯增多、染色明顯加深，NPR-B蛋白顯色指數為(30.67±1.59)%。兩組NPR-B蛋白顯色指數比較P＜0.01。

3 討論

NP通過與細胞膜上的NPR結合而發揮生物學作用［6］。NPR 主要有 3種:NPR-A、NPR-B 和 NPRC，均屬于膜受體。CNP主要與NPR-B結合［7］。NP抑制胃平滑肌的作用機制主要是通過NP-NPR-B/pGC-cGMP信號轉導途徑，使Ca2+外流，膜電位超極化［5～7］。正常生理條件下 CNP作用強于 ANP和BNP，且糖尿病胃動力障礙大鼠胃竇平滑肌對CNP的敏感性顯著增強［5］。

糖尿病并發癥發生發展中NP-NPR-B/pGC信號系統的改變起重要作用。Walther等［8］研究結果表明糖尿病小鼠心肌組織NPR-B信號增加，可導致心肌癥的發生、發展。Christoffersen等［9］報道糖尿病大鼠血管組織中ANP-NPR-A信號系統和CNPNPR-B信號系統上調，并阻止高血壓的發生、發展。此外，糖尿病大鼠腎組織ANP mRNA表達增強可能是為了參與適應糖尿病高糖高滲狀態［10］。這些結果提示糖尿病胃動力障礙大鼠胃組織中可能發生這些信號系統的改變。

本研究觀察到，CNP主要分布在胃竇平滑肌層，環行肌和縱行肌均有分布，并通過與平滑肌細胞膜上的NPR-B結合而發揮生理作用。腹腔注射STZ飼養4周的糖尿病組與正常對照組大鼠相比，胃竇平滑肌組織中CNP分布無明顯差異，而NPR-B在糖尿病組大鼠胃竇平滑肌中分布明顯增多。NPR-B上調可使胃竇平滑肌cGMP濃度增高，cGMP濃度增高勢必增強平滑肌的舒張作用，最終將導致胃動力障礙。以上結果提示，腹腔注射STZ飼養4周的糖尿病胃動力障礙大鼠胃中CNP-NPR-B/pGC-cGMP轉導系統起重要作用，其中NPR-B上調可能發揮關鍵作用。

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