以Cathelicidin序列為模板設計合成抗菌肽的抗菌特性研究

陳 曼，胡啟飛，陳登榜*，吳民瀘，代 娟，賴 翼，段佳慧

(1成都醫學院，成都610083;2麗珠集團四川光大制藥有限公司)

抗菌肽引起人們的廣泛重視與它獨特的殺菌機制和不易產生耐藥性有關，同時其抗菌譜廣、殺菌活力強，被認為是能夠替代抗生素的首選藥物，具有良好的應用前景［1］。但是直接提取或者人工合成的抗菌肽在殺菌的同時經體外實驗證實其產生了一定的副作用，如溶血性、細胞毒性等［2］。研究人員試圖通過在天然抗菌肽分子組成及結構的基礎上，通過保留和去除一部分氨基酸，重新設計合成一些新的多肽，這些多肽能夠繼承原肽鏈的生物學活性，同時副作用降低［3］。2010年1月～2011年5月我們進行本研究，使用的抗菌肽設計模板來自于抗菌肽家族Cathelicidin，是通過序列對比設計合成的多肽鏈［4］，由18個氨基酸組成，本研究將測定此抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抗菌活性及對人紅細胞的溶血性等。

1 材料與方法

1.1 材料 抗菌肽序列為GLLRRLRKKIGEIFKKYG，由成都凱捷生物醫藥科技發展有限公司合成，純度92.14%;金黃色葡萄球菌G+，為本實驗室保存;氨芐西林購于成都飛奧生物技術有限公司。

1.2 金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 采用NCCLS推薦的微量稀釋試驗。2 mg/ml的抗菌肽溶液用水解酪蛋白(MH)肉湯培養基在96微孔板上倍比稀釋，使終濃度在512～1μg/ml間成倍比降低，每孔體積100 μl。分別加入106CFU/ml的金黃色葡萄球菌菌液0.1 ml，37℃孵育24 h，觀察結果。以不出現云霧狀生長的最小肽濃度為MIC。取未渾濁的孔中液體10 μl接種在MH瓊脂平板上，37℃孵育24 h，計算菌落數，以能殺死99.9%的細菌的最小肽濃度為MBC。做2個平行實驗。

1.3 溶血性分析［2］枸櫞酸鈉抗凝全血在1 500 r/min離心10 min后得到人紅細胞。用等滲的20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)清洗3次，懸浮到正常紅細胞壓積的5%。用相同的緩沖液將抗菌肽稀釋成不同濃度，分別取體積960 μl加入40 μl的紅細胞懸液，37℃孵育30 min，1 500 r/min離心10 min，在540 nm波長下測定上清液的吸光度。等量的緩沖液和紅細胞懸液混合后，超聲完全破碎紅細胞，離心后的上清液作為對照組。

1.4 對金黃色葡萄球菌活力的動力學檢測 金黃色葡萄球菌在20 ml LB液體培養基中過夜培養12 h，加入10 ml新鮮培養基，然后將培養物分成相同體積的3份，分別加入相同體積的5×MIC抗菌肽、5×MIC氨芐西林和生理鹽水，37℃振蕩培養。每隔1 h取樣1 ml，連續取樣4 h。樣品在3 000 r/min離心5 min，保留沉淀物，加入3 ml的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)，離心，重復清洗1次，恢復到原體積。將細菌懸液系列稀釋，在MH瓊脂平板上計數，做5個平行實驗。

1.5 統計學方法 采用SPSS15.0軟件進行統計分析，使用t檢驗方法，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MIC和MBC結果 抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MIC為16 μg/ml、MBC為128 μg/ml。

2.2 溶血性 以抗菌肽濃度為橫坐標，實驗組與對照組在540 nm的吸光度的百分比為縱坐標，比較抗菌肽的溶血性，結果抗菌肽濃度為100 μg/ml時，溶血性低于對照組的10%。

2.3 對游離細菌的殺傷活力 經過抗菌肽作用4 h后，抗菌肽組、氨芐西林組、陰性對照組活菌數分別為(5.63±0.10)、(5.83±0.10)、(9.94±0.10)lg (cfu/ml)，陰性對照組比其他兩組活菌數均降低(P均＜0.05)。

3 討論

抗菌肽是生物防御系統的一個重要組成部分，是在生物體受到損傷或感染病菌的情況下產生的一類非專一性免疫應答物，幾乎存在于所有動植物中［5］。通過對已知抗菌肽的研究，認為大多數天然抗菌肽具有兩個共同特征，即幾乎都是陽離子型，及與水和脂類物質都具有親和力的兩親性結構［6］。對抗菌肽的殺菌機制的研究還沒有定論，但是普遍認為與抗菌肽肽鏈形成的二級結構及抗菌肽的生物學特性有關［7］。

本研究使用的肽鏈模板來自于抗菌肽家族Cathelicidin，通過對比多條天然抗菌肽的分子結構而得到，新肽鏈含有能形成α－螺旋結構的分子組成，繼承了原肽鏈的主要理化性質，是具有疏水性、帶有正電荷的兩性分子［4］。對它的C末端酰胺化以后顯示了較強的抗菌活性。經實驗測得抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為16 μg/ml和128 μg/ ml，對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。在金黃色葡萄球菌菌液中分別加入5×MIC濃度的抗菌肽和氨芐西林后，經相同條件作用4 h，抗菌肽組和氨芐西林組的活菌數均較陰性對照組降低。同時發現抗菌肽的溶血性遠遠小于抗菌活性較強的一些天然抗菌肽［8］。進一步說明對抗菌肽分子結構改變和修飾可以保留其抗菌活性并減少副作用。此外，抗菌肽還具有廣譜抗菌、不易產生耐藥性等特點［9］。

但是抗菌肽的副作用還需要進一步研究，如其是否具有細胞毒性、作用環境對抗菌活性的影響等。研究抗菌肽分子組成與生物學活性的關系不失為好的方法，通過研究氨基酸組成、結構和生物學功能的對應關系，期望研制出有高抑菌活性和較少毒性的抗菌肽，以更好的應用于臨床。

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