我國部分地區傳染性羊癢病基因型的分布情況調查

肖 妍，董志珍，欒慎順，陳本龍

（天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461）

羊癢病（scrapie）是傳染性海綿狀腦病（TSE）的原型，是由羊癢病朊病毒引起成年綿羊和山羊的一種慢性進行性的、致死性神經系統疾病，能引起綿羊和山羊中樞神經系統發生退化變性，病羊具有中樞神經系統變性、空泡化、星形膠質細胞增生等特點，瘙癢是癢病的一個顯著特征，此外， 共濟失調、麻痹、衰弱、震顫、姿勢不穩、癡呆、知覺過敏、行為異常等神經癥狀也是其主要的臨床癥狀，死亡率達100%[1-3]。

羊癢病可通過病羊的肉骨粉等傳染給牛，而使牛感染為瘋牛病。人食用了被瘋牛病病原污染的食品，可感染上傳染性海綿狀腦病—新變異型克雅氏病（即nvCJD）。因此，羊癢病的診斷是根除和控制瘋牛病、克雅氏病的關鍵。而到目前為止，在檢測瘋牛病和羊癢病等方面開發出的免疫組織化學方法、免疫轉印方法、組織印記法、ELISA方法、western-blot等方法均為死后診斷和確診法，不利于本病的控制和根除[4-5]。

引起羊癢病的病原是一種無核酸的蛋白質侵染顆粒朊蛋白（Prion protein， PrP），是由宿主神經細胞表面正常的一種唾液酸糖蛋白（PrPc）在三級結構發生改變后形成的異常蛋白（PrPsc），由于英國“瘋牛病”的發生使得此蛋白備受研究人員的關注[6-7]。

研究表明， 羊癢病的發生與綿羊朊蛋白編碼基因PRNP遺傳多樣性密切相關，主要表現在綿羊PRNP第136、154和171位密碼子組成的PRNP基因型與綿羊對癢病的抗病性相關[8-10]。患有TSE的病羊其基因組中的三個等位基因發生了突變，即136位點上的A突變成了V、154位點上的R基因突變成了H基因，171位點上的Q基因突變成了R或H，研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不會感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型，易患TSE[11-13]。也有研究稱含有雜合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊癢病，但是當有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴隨時，羊很少有感染羊癢病的報道。本研究旨在利用已建立的利用熒光定量PCR擴增反應進行單核苷酸多態性（SNP）快速分析的方法對羊癢病抗性基因進行篩選，對我國部分地區的羊癢病基因型分布情況進行調查，從而從品種選育水平上杜絕羊癢病的發生。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各型綿羊PRNP基因標準品由意大利Institut zooprofi lattic sperimen DELLA SARDEGNA 惠贈 ；基因擴增預混液Taqman Universal PCR MasterMix購于Applied Biosystems試劑公司；基因組DNA提取試劑盒購于TIANGEN試劑公司。

1.2 綿羊基因組DNA的提取

按照TIANGEN血液基因組 DNA提取試劑盒說明提取。

1.3 熒光定量PCR檢測

選 取 20 μL PCR 反 應 體 系 ：2×mastermix：10μL；DNA：2 μL；上游引物（10 μM）：2 μL；下游引物（10 μM）：2 μL；FAM標記的探針（10 μM）：0.5μL；VIC 標記的探針（10 μM）：0.5 μL；雙蒸水補齊至 20 μL。

樣品放入Roche LightCycler 480熒光定量PCR擴增儀進行檢測，其實時熒光定量PCR擴增程序如下 ：50 ℃ 2 min ；95 ℃ 10 min ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共35~40個循環，每個循環延伸末期采集數據。

反應結束后立即進行終點讀板分型，選擇標記探針的兩種檢測信號FAM和VIC，程序如下：61 ℃預熱1 s，60 ℃連續讀板，同時收集5個信號。

機器將根據記錄的數據將兩種熒光信號進行比較計算，自動分型。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR 的擴增

采用終點讀板基因分型模式（Endpoint Genotyping）檢測483~533 nm通道（FAM）和523~568 nm通道（VIC）的數據，經過計算比較二者的比值，得到基因分型散點圖（見圖1）。各標準品均按其基因型表現為純合子（136AA、136VV、154RR、154HH、171RR、171HH、171QQ）及雜合子（136VA、154RH、171RH、171RQ和171HQ），說明引物及探針設計的特異性完全能夠用于SNP快速分析。

2.2 樣本檢測結果

表 1 樣本檢測結果

基因型分布情況見圖2~7。

3 討論

綿羊的基因型與發生羊癢病有著重要的關系，如表1所列[14]。

不同PrP基因型對羊癢病的敏感性不同，因此篩選出對TSE有抗性的羊群是控制和根除本病的關鍵，目前的科學研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不會感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型，易患TSE，因此可根據朊蛋白的基因型而采取相應的措施和計劃來控制羊癢病、瘋牛病等。

表 2 綿羊PrP基因型與羊癢病發生的危險性

經過我們對北京、天津、新疆、云南4個地區的254份無角多賽特綿羊血液樣本進行基因分型試驗，結果表明，ARR/ARR或ARR/ARQ抗性基因型所占比例為44%；基因型ARR/ARH 所占比例為9%，此基因型對羊癢病有抗性，但育種時要選育；對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%，其中新疆所檢74份樣品中未檢出，北京100份樣品中檢出9份，比例為9%，天津和云南所檢40份樣品中各檢出1份，比例為2.5%。

對于羊癢病有較高易感性的基因型ARQ/ARQ，ARH/ARQ，ARH/ARH，ARH/AHQ，ARQ/AHQ，AHQ/AHQ所占比例分別為27%，10%，3%，1%，2%和0.4%，由此可見，我國以上四個地區的無角多賽特綿羊PrP基因型的分析可知，我國飼養的綿羊抗性基因型的比列占到了53%，一半以上的綿羊具有羊癢病抗性，可以用于育種和基因篩選；對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%，對于此基因型的綿羊不能用于育種，應將羔羊宰殺或閻割；對于羊癢病有較高易感性的基因型占到了43%，對于此類型的綿羊對羊癢病有較小的抗性，可以賣掉或在某一階段用于育種。

[1] Prusiner S B. The Prion Diseases[J]. Sci Am，1995，272（1）：48-56.

[2] Aguzzi A，Heppner F. Pathogenesis of prion diseases： a progress report[J]. Cell Death Differ，2000，7（10）： 889-902.

[3] Combrisson H，Robasine G，Brugere H，et al. Urodynamic parameters in scrapie-affected ewes and their modifi cations in the course of the disease[J]. Neurourology Urodyn，1998，17（5）：555-563.

[4] Stanley B P . Prion Diseases and the BSE crisis[J]. Science，1997，78（10）：245-251.

[5] Somerville R，Hamilton S，Fernie K.Transmissible spongiform encephalopathy strain，PrP genotype and brain region all affect the degree of glycosylation of PrPSc[J]. J Gen Virol，2005，86（1）：241-246.

[6] Kazuhiko A，Noriyuki N，Suehiro S ，et al. Biological and Biochemical Characteristics of Prion Strains Conserved in Persistently Infected Cell Cultures[J]. J Virol，2005，79（11）：7104-7122.

[7] Thierry B，Carole C，Anne-Gaёlle B. Molecular Analysis of the Protease-Resistant Prion Protein in Scrapie and Bovine Spongiform Encephalopathy Transmitted to Ovine Transgenic and Wild-Type Mice [J]. J Virol，2004，78（12）：6243-6251.

[8] Vaccaria G，Contea M L，Morellia G，et al. Primer extension assay for prion protein genotype determination in sheep[J]. Mol Cell Probe，2004，18（1）：33-37.

[9] Westaway D，Zuliani V，Cooper C，et al. Homozygosity for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders sheep susceptible to natural scrapie [J]. Genes Dev，1994，8（8）：959-969.

[10] Tranulis M A. Infl uence of the prion protein gene，Prnp， on scrapie susceptibility in sheep [J]. Apmis， 2002，110（1）： 33-43.

[11] Buschmann A，Lühken G，Schultz J，et al. Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a scrapie-resistant genotype （PrPARR/ARR）[J]. J Gen Virol，2004，85（9）：2727-2733.

[12] Hamir A N， Kunkle R A， Richt J A， et al. Experimental transmission of sheep scrapie by intracerebral and oral routes to genetically susceptible Suffolk sheep in the United States[J]. J Vet Diagn Invest，2005，17（1）：3-9.

[13] Baylis M， McIntyre K M. Transmissible spongiform encephalopathies：scrapie control under new strain[J]. Nature，2004，432（7019）：810–811.

[14] Truls M，Ingrid O，Pitter H，et al.Polymorphisms at condons 141 and 154 in the ovine prion protein gene are associated with scrapie Nor98 cases. [J]. J Gen Virol，2005，86（5）：231-235.