體外轉錄法制備西尼羅河熱病毒RNA片段

鄒艷麗，趙永剛，張永強，包靜月，孫成友，王君瑋，李金明，王志亮

（中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病診斷中心，山東青島 266032 ）

西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）是黃病毒科黃病毒屬成員，它會引起人畜共患病[1]。因于1937年首次從非洲烏干達西尼羅河地區一名發熱婦女血液中分離到而得名[2]。與日本腦炎病毒、墨累河谷腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒和昆津病毒同屬日本腦炎病毒血清群。該病毒是蚊媒病毒，主要經庫蚊傳播給人、馬和鳥類等，可引發西尼羅河熱和致死性的西尼羅河病毒性腦膜腦炎，其中西尼羅河熱被世界動物衛生組織列為重大疫病。西尼羅河病毒分布廣泛，1950年埃及3名兒童的血液中分離到病毒，60年代早期第一次報道從埃及和法國的馬中分離到病毒[3]。據報道，已從以色列、南非、剛果、印度等地分離到病毒，此后西尼羅河病廣泛分布于非洲和中東。近幾年，阿爾及利亞（1994）、羅馬尼亞（1967—1997）、捷克（1997）、剛果（1998）、俄羅斯、美國（1999）都先后暴發過西尼羅河熱[4]。在世界上許多國家和地區引起流行，造成人、馬和鳥類的大量感染及死亡，給發病國家造成重大危害，成為全球獸醫界和公共衛生部門的一大難題。我國目前還沒有發現西尼羅河病毒，但存在傳入的風險，因此建立快速、準確的檢測方法對于我國預防該病毒的入侵具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 質粒DH5α購自大連寶生物公司，EII基因由上海生工合成并克隆到PUC59載體上。PGEM-T-easy載體購自Promega公司。

1.1.2 主要試劑 普通PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒、DL2000均購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒購自上海華舜公司，Riboprobe System-T7體外轉錄試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據WNV毒株的EII蛋白基因序列，設計引物。

WNV5ST75′- TAATACGACTCTATAGGGCGATTT TTTTTTTTTTTTATGGGAGAAGCT CAC AAT GAC-3′；WNV6R 5′- GCAAGGTCCATCCGTGCCAGTGTAC-3′

在上游引物的5'端引入T7啟動子。引物由大連寶生物工程公司合成。

1.2.2 序列合成 根據大腸桿菌表達密碼子偏愛性和密碼子的簡并性修改并合成序列。

ATG GGA GAA GCT CAC AAT GAC AAA CGT GCT GAC CCA GCT TTT GTG TGC CGTCAA GGA GTG GTG GAC CGT GGC TGG GGC AAC GGC TGC GGA CTG TTT GGC AAA GGA AGC ATT GAC ACA TGC GCC AAA TTT GCC TGC TCT ACC AAG GCA ATC GGACG T ACC ATC TTG AAA GAG AAT ATC AAG TAC GAA GTG GCC ATT TTT GTC CAT GGACCA ACT ACT GTG GAG TCG CAC GGA AAC TAC TCC ACA CAG GCT GGA GCC ACT CAG GCA GGG CGT TTC AGC ATC ACT CCT GCG GCG CCT TCA TAC ACA CTG AAG CTT GGA GAA TAT GGA GAG GTG ACA GTG GAC TGC GAA CCA CGT TCA GGG ATT GAC ACC AAT GCA TAC TAC GTG ATG ACT GTT GGA ACA AAG ACG TTC TTG GTC CAT CGT GAG TGG TTC ATG GAC CTC AAC CTC CCT TGG AGC AGT GCT GGA AGT ACT GTG TGG CGT AAC CGT GAG ACG TTA ATG GAG TTT GAG GAA CCA CAC GCC ACG AAG CAG TCT GTG ATC GCA TTG GGC TCA CAA GAG GGA GCT CTG CAT CAA GCT TTG GCT GGA GCC ATT CCT GTG GAA TTT TCA AGC AAC ACT GTC AAG TTG ACG TCG GGT CAT TTG AAG TGC CGT GTG AAG ATG GAA AAA TTG CAG TTG AAG GGA ACA ACC TAT GGC GTC TGC TCA AAG GCT TTC AAG TTT CTT GGG ACT CCGGCA GAC ACA GGT CAC GGC ACT GTG GTG TTG GAA TTG CAG TAC ACT GGC ACG GAT GGA CCT TGC

1.2.3 PCR擴增 反應體系為：DNA 1 μL，上下游 引 物（25 pmol）各 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，總體系25 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；最后72℃延伸7 min。

1.2.4 連接與轉化 在T4 DNA連接酶作用下，純化的PCR產物與PGEM-T easy載體于25 ℃連接1 h后，用CaCl2法制備感受態細胞，將連接產物轉化至DH5α細胞中。

1.2.5 重組質粒篩選與鑒定 使用藍白斑試驗篩選重組質粒，挑取白色菌落轉接至含氨芐青霉素100 μg/mL的LB培養液中，37 ℃，210 r/min培養過夜，提取質粒DNA。以質粒為模板，利用設計的引物進行PCR擴增，檢查插入片段的大小，根據目的片段大小來判定其陽性，送交上海生工進行雙向測序。

1.2.6 重組質粒載體的線性化處理與濃度測定 質粒用NdeⅠ內切酶經37℃消化2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物，觀察線性化結果。

1.2.7 體外轉錄、模板RNA標準品的制備 利用Riboprobe System-T7試劑盒，室溫配制20 μL反應體系：5×Buffer 4 μL，DTT （100 mmol/L）2 μL，RNasin（40U）1 μL，rNTP （終濃度各為0.5 mmol/L）5 μL，線性化質粒（0.3 μg/μL） 2 μL，T7 poly（18 U）1 μL，DEPC H2O 5.5 μL。反應條件為 37 ℃ 1 h。轉錄產物加Dnase（1 U/μL）1.5 μL繼續反應20 min除去DNA模板，用RNA轉錄純化試劑盒進行純化并用NanoDrop ND1000分光光度計定量。轉錄產物濃度可以換算為拷貝/μL。拷貝數=濃度×阿伏加德羅常數/ （1個堿基對的平均分子質量×總長度），阿伏加德羅常數為6.02×1023。用DEPC水將其分別依次梯度稀釋，取各稀釋液作模板，進行RT-PCR，引物和擴增條件與前述步驟相同。分裝作為標準品，-80 ℃凍存。

2 結果

2.1 西尼羅河熱病毒基因重組質粒的PCR鑒定

以Trizol提取的RNA為模板，用WNV5ST7，WNV6R為引物，經PCR擴增后應得818 bp長的片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴增出的目的片段大小與預期值相符合（圖1）。

2.2 測序結果比對

登錄Genebank，將質粒插入片段的測序結果進行比對，結果顯示，克隆的DNA序列與合成的基因序列相應片段的同源性100%，證實堿基序列正確，能夠進入下一步的體外轉錄等試驗。

2.3 cRNA標準品質量濃度測定

體外轉錄的cRNA經核酸蛋白測定儀測定，其質量濃度為352.6 ng/μL，D260 nm/D 280 nm 分別為1.92。根據拷貝數計算公式，將其梯度稀釋為5.0×1011～5.0×102拷貝 /μL-80℃保存。

2.4 體外轉錄結果鑒定

以梯度稀釋的體外轉錄RNA產物作模板，作RTPCR。體外轉錄產物RT-PCR電泳結果見圖2。由圖可知，PCR產物為818 bp，且轉錄產物質量濃度5.0×102拷貝/μL時，仍出現清晰目的條帶，在質量濃度為5.0×102拷貝/μL時均出現清晰目的條帶。

3 討論

建立特異、敏感、快速的西尼羅河熱病原診斷方法，是我國對外來疫病西尼羅河熱防控技術儲備需要。我們為此制備了西尼羅河熱病毒的RNA標準品，為以后的檢測作陽性對照來用。

本研究采用構建含有T7啟動子的重組質粒，直接用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄獲得RNA片段，并準確定量，可作為西尼羅河熱病毒的核酸擴增快速診檢技術方法的陽性對照，無生物安全隱患。同時也避免了以往研制的商品化試劑盒中質粒標準品不能很好地對樣品處理及逆轉錄過程進行有效控制的問題[5-6]。

本研究成功克隆了西尼羅河熱病毒的保守基因，并構建了相應的重組質粒，進行體外轉錄獲得了陽性RNA標準品，進行了準確定量，為進一步開展西尼羅河熱病毒的功能、結構等研究奠定了基礎，同時為后續建立和優化西尼羅河熱病毒核酸快速檢測的方法學研究，如實時熒光定量PCR、依賴核酸序列的擴增（NASBA）和環介導的等溫擴增（LAMP）技術等，提供了基礎。

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