誘導型一氧化氮合酶及缺氧誘導因子-1α在人腦膠質瘤的表達意義與腫瘤血管生成關系的研究

胡偉鑫 陳春美 石松生 楊衛忠 李紹熹 葉金練

1)福建安溪銘選醫院神經外科 安溪 362400 2)福建醫科大學附屬協和醫院神經外科 福州 350001

實體瘤生長到一定程度時,腫瘤細胞增殖的速度超過腫瘤血管生成的速度。細胞對氧和營養物質的消耗,可導致腫瘤微環境為低氧分壓、低糖和酸性。這種情況激活缺氧誘導因子HIF(主要是 HIF-1α),從而誘導血管生成、促進糖酵解,增強腫瘤細胞適應低氧的微環境[1]。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)廣泛參與了膠質瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程,與膠質瘤的發生、發展密切相關[2]。本實驗采用免疫組化檢測低度和高度惡性膠質瘤標本,分析iNOS、HIF-1α和VEGF在膠質瘤中表達特點及其相關性,為后期膠質瘤靶基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 羊抗人的iNOS、HIF-1α和VEGF單克隆一抗體、SP法免疫組化超敏試劑盒和DAB染色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 研究對象 收集協和醫院神經外科2005-06～2008-01手術切除的人腦膠質瘤新鮮標本86例,男54例,女32例,年齡最小12歲,最大73歲,平均45.4歲。所有病例均為手術后病理學切片證實為膠質瘤,且均為第一次手術,術前均未行任何抗腫瘤治療。按照2000年WHO腦腫瘤分類標準：Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質瘤,低度惡性組)42例,Ⅲ～Ⅳ(高度惡性膠質瘤,高度惡性組)級44例。其中低度惡性組42例包括星形細胞瘤Ⅰ、Ⅱ級27例,少突膠質細胞瘤7例,室管膜下瘤5例,少突-星形細胞瘤 3例;高度惡性組42例,包括膠質母細胞瘤16例,間變性星形細胞瘤11例,間變性少突膠質細胞瘤8例,間變性少突-星形細胞瘤7例。另取腦外傷病人行內減壓手術而取得的新鮮腦組織10例(正常腦組織組)作為對照組。

1.3 免疫組織化學(SP法)檢測iNOS、HIF-1α和 VEGF在不同組標本中表達 取膠質瘤和腦外傷正常腦組織各一份,10%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,3.0μm厚連續切片,石蠟切片脫蠟至水,抗原修復,加50μL內源性過氧化物酶阻斷液(A液)孵育,漂洗,加 50μL非免疫動物血清(B液)孵育,分別加入50μL的羊抗人 iNOS、HIF-1α和 VEGF一抗,置濕盒4℃孵育過夜,PBS沖洗,加生物素標記二抗50μL(C液)孵育,鏈霉素-生物素-過氧化物酶復合體溶液孵育,DAB呈色,蘇木素復染細胞核,常規梯度酒精脫水之后封片,中性樹膠封片,取正常腦組織對照。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件對所獲數據進行統計學分析。選用兩樣本t檢驗和單因素方差分析、線性回歸分析,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 HIF-1α抗原的表達定位于部分正常腦組織和膠質瘤細胞核上,為黃色或棕黃色顆粒,在腫瘤浸潤邊緣表達明顯。對照組正常腦組織細胞核中不表達或低表達;低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性組呈強陽性表達,HIF-1α抗原在3組之間表達強度差異均具有統計學意義(P＜0.05),見表 1、圖 1。

2.2 iNOS抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 iNOS抗原的表達定位于膠質瘤細胞細胞漿,為黃色或棕黃色顆粒。對照組正常腦組織中不表達;低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性組呈強陽性表達,iNOS抗原在2組之間表達強度差異均具有統計學意義(P＜0.05),見表1、圖1。

2.3 VEGF抗原在對照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達特點 VEGF抗原的表達定位在正常腦組織組和膠質瘤組細胞均有表達,血管內皮細胞也有表達,呈棕黃色或棕褐色顆粒,其中正常腦組織弱陽性表達,低度惡性組呈陽性表達,而高度惡性呈強陽性表達,3組之間表達強度差異均具有統計學意義(P＜0.05),見表1、圖1。

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對照組和膠質瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對照組和膠質瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

注：與對照組比較,#P＜0.05;與低度惡性組比較,*P＜0.05

組別 n HIF-1α iNOS VEGF對照組 10 71.09±15.74 066.23±8.11低度惡性組 42 196.83±35.52 137.56±8.04#266.26±19.63#高度惡性組 44 348.20±37.16 429.75±62.19#*395.80±70.82#*

圖4 iNOS和VEGF抗原在膠質瘤中線性回歸

2.4 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在膠質瘤中表達的相關性分析 根據免疫組化結果進行各種抗原表達相關性分析,在膠質瘤組中,HIF-1α和 iNOS、HIF-1α和 VEGF、iNOS和VEGF均存在正相關關系(r=0.925、0.740、0.852,P值均＜0.05)。見圖2～4。

3 討論

iNOS在缺血、缺氧、腫瘤、損傷時高表達,它可以催化底物L-精氨酸的胍基氮產生NO,發揮復雜的病理生理學作用。研究發現,iNOS及其產物NO廣泛參與了腫瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程,與腫瘤的發生、發展密切相關。腫瘤在缺氧甚至有氧狀態下增加糖酵解酶活性而加速糖酵解來獲取能量,缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)發揮重要的作用,在腫瘤生長、浸潤和轉移、治療等方面都有重要意義。血管內皮生長因子(VEGF)在促進腫瘤血管形成和生長中起著重要作用,主要有[3-4]：(1)增加血管通透性：為腫瘤的生長、浸潤和轉移提供合適的基礎;(2)促進血管生成;(3)調節細胞周期、抑制凋亡、抑制腫瘤免疫等。目前iNOS、HIF-1α和VEGF三者在膠質瘤的表達特點的相關性還不明確。

目前研究認為,在腫瘤的發生與發展過程中,iNOS、NO、VEGF相互作用促進腫瘤性血管的生成,其中以VEGF的作用更為直接,同時,VEGF受到 iNOS、NO的嚴密調控[5-6]。iNOS不僅通過產物NO和VEGF相互作用發揮其促血管生成作用,iNOS還可以與VEGF受體結合來調節血流量,促進腫瘤生長和轉移。Papapetropoulos等學者認為,iNOS、HIF-1α在腫瘤血管形成相互關系可能機制：HIF-1α蛋白穩定性增加,不容易降解,上調iNOS表達,進而上調NO,NO是一種重要的炎癥介質,能促進VEGF與其受體結合,促使內皮細胞拉長、伸展,發生有絲分裂、移行和血管的進一步形成[7]。

本實驗中 iNOS在正常腦組織沒有表達,HIF-1α和VEGF抗原在正常腦組織低表達,三種蛋白在膠質瘤細胞的胞質中均有表達,而且高度惡性組表達均明顯強于低度惡性組,惡性度越高,表達量越多,說明 iNOS、HIF-1α和 VEGF三種基因與膠質瘤惡性度相關,參與膠質瘤發生發展過程。采用SPSS軟件分析結果顯示,iNOS、HIF-1α和VEGF三種基因在正常腦組織組、低度惡性組和高度惡性組關系存在兩兩正相關關系,進一步證實 HIF-1α、iNOS和 VEGF等三種基因共同參與膠質瘤發生發展過程,HIF-1α和iNOS相互協調,HIF-1α和iNOS二者在膠質瘤發展過程中存在相互促進作用,其機制可能為在腫瘤缺氧條件下HIF-1α表達水平增高,誘導iNOS表達,而iNOS催化精氨酸產生的NO,后者則誘導HIF-1α表達,形成正反饋環,促進膠質瘤異常增殖;HIF-1α和iNOS共同促進調控VEGF表達,后者是直接促進膠質瘤血管形成和生長中最為關鍵的因子,三者相互協調,共同促進膠質瘤生長、增殖和轉移過程。

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