視網膜光感受器細胞外基質蛋白質SPACR的分離純化

趙勁松,黃嵐峰,王淑榮

(吉林大學第二醫院 1.眼科醫院 眼底病一科;2.骨科,吉林 長春 130041）

Interphotoreceptor matrix(IPM）是視網膜色素上皮細胞頂端和外界膜之間存在的細胞外基質,在視功能中很多生物學反應都是通過這個視細胞外間質起著重要作用,比如視色素轉運,代謝產物的運輸,細胞間信息交流,光感受器分化調節和排列等。IPM化學成分主要有透明質酸和蛋白質,其中分子量為150kDa的sialoprotein associated with cones and rods(SPACR）為主要蛋白質[1],迄今為止關于SPACR的研究尚不多。為進一步研究SPACR的功能,本文建立了從視網膜分離提純SPACR蛋白的技術,期待為進一步研究SPACR活性、結構及功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物SPACR是不溶于PBS的蛋白質[1],取白來杭雞視網膜,按照[1,2]獲取白來杭雞不溶于PBS的IPM成分。

1.2 試劑和儀器DEAE-Sephacel來自Amersham Biosciences,Sephacryl S-300 HR來自Amersham Biosciences,Mini-Protean II 2-D系統、SDS-PAGE電泳裝置及電泳膠來自Bio-Rad。所有試劑均來自Bio-Rad公司和國產分析純。SPACR抗體O46-F由日本Dr.Zako惠贈,其二抗peroxidase-conjugated protein A(1:3000）來自ICN.

1.3 緩沖液配制

1.3.1 組織裂解液配制 50 mM Tris-HCl pH 8.0,10 mM EDTA,1 mM PMSF,7 M urea,0.5%Triton X-100。

1.3.2 雙向電泳上樣緩沖液配制 1.6%Bio-lyte 5/7 ampholyte,0.4%Bio-lyte 3/10 ampholyte,9.5 M urea,2.0%Triton X-100,5%β-mercaptoethanol。

1.3.3 雙向0.9×57-mm管狀凝膠制作配方 Urea 5.5g,丙烯酰胺儲存液(acrylamide）1.33ml,10%(w/v）Triton X-100 2ml,40%Bio-lyte 5/7 ampholyte 400 μ l,40%Bio-lyte 3/10 ampholyte 100 μ l,10%過硫酸銨(APS）10 μ l,N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED）10 μ l,加水至10 ml。(終濃度 9.2 Murea,4%acrylamide,2.0%Triton X-100,1.6%Bio-Lyte 5/7 ampholyte,and 0.4%Bio-Lyte 3/10 ampholyte,0.1%TEMED,0.01%APS）。

1.3.4 雙向電泳平衡緩沖液 62.5 mMTris-HCl,pH 6.8,2.3%(w/v）SDS,5.0%(v/v）β--mercaptoethanol,10%(w/v）glycerol。

1.3.5 透析液 4M guanidinium chloride,0.5%Triton X-100,50 mM Tris-HCl pH 8.0。

1.4 方法

1.4.1 DEAE-Sephacel離子交換層析 頸部脫臼法處死白來杭雞,在解剖顯微鏡下,冰上操作,按照Acharya[1,2]方法獲取不溶于PBS的IPM成分作為粗提物,并重新溶于裂解緩沖液,4℃充分勻漿12 h,15000 rpm,4℃離心30 min,取上清液并上樣于平衡過的DEAE—Sephacel離子交換柱(5 cm×50 cm）,上樣后用初始緩沖液充分洗凈未吸附的蛋白質,再用含有0.15-1M NaCl的緩沖溶液進行梯度洗脫并收集各組分,用紫外分光光度儀分別檢測每管樣品的A280值,并用Western blot法測定SPACR所在之處。

1.4.2 Sephacryl S-300 HR凝膠過濾層析 將DEAE-Sephacel離子交換層析洗脫下來含有目的蛋白質的吸收峰合并、濃縮,4℃條件下透析,用10 mM dithiothreitol 37℃還原30 min后上樣于平衡過的Sephacryl S-300凝膠層析柱,收集各組分,于紫外分光光度儀分別檢測每管樣品的A280值,經濃縮后,用Western blot鑒定SPACR的分布。

1.4.3 雙向電泳(two-dimensional electrophoresis）:分別取各組蛋白質樣品20 μ g,加入上樣緩沖液,混勻進行一向等電聚焦電泳。按下述步驟進行電泳:500V 10min,750V 4 h。電泳后取出膠條,置于平衡緩沖液中平衡10 min,將平衡好的膠條放入7.5%SDS—PAGE凝膠中,進行二向電泳,75V,20min,120 V直至溴酚藍前沿距離玻璃板下緣0.5 cm處停止電泳,經電轉膜,行考馬斯亮藍染色及Western blot免疫印跡。

1.4.4 蛋白質含量測定 蛋白質含量按Lowry法[3]和分光光度法進行測定,以牛血清白蛋白為標準樣品。柱層析過程中的蛋白質檢測用紫外分光光度計在280 nm下進行。

1.4.5 SDS-PAGE和Western blot免疫印跡 蛋白質樣品加入上樣緩沖液,混勻,95℃,5 min,加樣于7.5%SDS-PAGE凝膠孔中,電泳后電轉移至PVDF膜上,用10%脫脂牛奶封閉1 h,PBS洗滌后,加入O46-F孵育1h,PBS洗滌后加入peroxidase-conjugated protein A孵育1 h,PBS洗滌后,X線片顯影、定影。

2 結果

2.1 DEAE-Sephacel離子交換層析結果

粗提物上樣于DEAE離子交換層析柱后的洗脫曲線,可見兩個洗脫峰(圖1）,經 DEAE-Sephacel離子交換層析后部分雜蛋白被低離子強度的緩沖液洗脫下來,而第2個蛋白峰則在離子強度較強時被洗脫下來。經7.5%SDSP-PAGE電泳及western-blot分析顯示SPACR在第2個蛋白峰內(圖略）。

圖1 DEAE離子交換層析柱的洗脫曲線

圖2 Sephacry1 S-300 HR凝膠過濾層析的洗脫曲線

2.2 Sephacryl S-300 HR凝膠過濾層析結果

收集合并DEAE-Sephacel離子交換層析洗脫的第2個蛋白峰,上樣于Sephacryl S-300 HR凝膠過濾層析,圖2是經Sephacryl S-300 HR進一步純化的洗脫曲線圖,圖中出現4個洗脫峰。蛋白質分子按分子大小被分離,大分子物質先被洗脫下來,小分子物質洗脫速度較慢。收集洗脫液,進行western-blot分析,發現SPACR在第2個洗脫峰(圖略）。

2.3 各階段的純化效果

比較粗提蛋白液和經DEAE-Sephacel離子交換及Sephacryl S-300HR凝膠過濾層析純化后的蛋白樣品的雙向電泳結果,粗提溶液內蛋白質較多,分子量150 kDa處無明顯蛋白質條帶,而經過DEAE-Sephacel離子交換層析純化后,蛋白質種類明顯減少,再經過Sephacryl S-300HR凝膠過濾層析純化,雙向電泳顯示蛋白質得到進一步純化,分子量150 kDa處有4個蛋白質點,經過western-blot驗證表明與SPACR抗體反應(圖3）。通過幾種分離方法,我們得到了比較純的SPACR。

圖3 IPM粗提物(圖A）經DEAE-Sephacel離子交換層析(圖B）及 Sephacry1 S-300HR凝膠層析(圖C）提純后行雙向電泳,并行考馬斯亮藍染色。圖D為圖C的樣品同樣經雙向電泳后O46-F抗體免疫印跡結果。分子量標于圖左側,等電點標于圖上方。

3 討論

SPACR因為不溶于PBS,得到視網膜總蛋白后用PBS去掉可溶性蛋白質,即為粗提產物。根據SPACR的理化性質,我們采用DEAE-Sephacel離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠層析純化SPACR。DEAE離子交換層析是利用一些帶離子基團的纖維素,吸附交換帶相反電荷的蛋白質。由于各種蛋白質的等電點不同,所帶的電荷量不同,與纖維素結合的能力有差別。DEAE是一種陰離子交換劑,當蛋白質溶液通過DEAE柱時,帶負電荷的蛋白質可以被DEAE吸附,帶正電荷的蛋白質則不被吸附而隨溶液流出。純化SPACR時可選擇pH值大于SPACR等電點的緩沖液,此時SPACR帶負電荷,可以通過電價鍵吸附于DEAE離子交換劑上,粗提物中的帶正電荷的蛋白質不能被吸附而被去掉,然后用增加鹽濃度的方法將結合的蛋白質按照結合力不同而分別洗脫下來,經SDS-PAGE檢測,SPACR在離子強度較高條件下被洗脫下來。

凝膠層析是利用分子篩作用對蛋白質進行分離。凝膠是具有三維空間多孔網狀結構的物質,經過適當的溶液平衡后,含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠層析柱時,大分子物質不易進入凝膠顆粒的微孔,只能分布于顆粒之間,因此在洗脫時向下移動的速度較快,最先被洗脫。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外,還可以進入凝膠顆粒的微孔中,洗脫時向下移動的速度較慢,隨后被洗脫。因此,蛋白質分子按分子大小被分離。IPM的粗提物經過DEAE—Sephacel離子交換層析后,含有SPACR的樣品再上樣于Sephacryl S-300凝膠層析,SPACR分子量大約150kDa,屬于大分子物質,不易進入凝膠顆粒的微孔中,而在凝膠顆粒之間移動,被先洗脫下來,這樣可以分開SPACR和小分子物質。

雙向電泳方法第一向為等電聚焦,基本原理是利用蛋白質分子的等電點不同,在一個穩定、連續、線性pH梯度中進行蛋白質的分離。第二向為SDSPAGE,它是按蛋白質分子量的大小進行分離。通過雙向電泳進一步分離出和SPACR分子量相差不多而等電點不同的蛋白質。

以上實驗結果表明,DEAE—Sephacel離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠層析,選擇適合的洗脫條件分離純化SPACR可獲得良好的效果。本研究建立了實驗室分離純化SPACR的技術參數和方法,具有較好的分辨率和重復性,為進一步進行視網膜蛋白質SPACR的研究奠定了基礎。同時初步建立了視網膜蛋白質組雙向電泳分析方法,具有較好的分辨率和重復性,本實驗建立的技術也為進一步進行視網膜蛋白質組學研究奠定基礎。

[1]Acharya S,Rodriguez IR,Moreira EF,et al.SPACR,a novel interphotoreceptormatrix glycoprotein in human retina that interacts with hyaluronan[J].J Biol Chem,1998,273(47）:31599.

[2]Acharya S,Rayborn ME,Hollyfield JG.Characterization of SPACR,a sialoprotein associated with cones and rods present in the interphotoreceptormatrix of the human retina:immunological and lectin binding analysis[J].Glycobiology,1998,8(10）:997.

[3]Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1）:265.