丹參多酚酸鹽及神經肽Y干預后癲癇大鼠海馬神經肽Y的表達變化

陳麗麗,黃靚妹,詹紅艷,曹亦賓,張 宏

(唐山工人醫院 1.神經內科;2.急診內科,河北 唐山 063000）

癲癇是由于腦部神經元異常過度放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經系統功能失常的慢性疾病和綜合征。神經肽Y(neuropeptide-Y,NPY）是由36個氨基酸殘基組成的多肽,廣泛分布于哺乳動物中樞和外周神經系統,是含量最豐富的神經肽之一。研究發現NPY與癲癇密切相關,癲癇發作后海馬中NPY釋放量明顯增多,且對癲癇有保護作用。丹參多酚酸鹽注射液是國家二類中藥新藥。自2005年5月獲批應用以來,證實它具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循環、抗氧化損傷的作用。本課題擬采用免疫組織化學方法觀察PILO所致大鼠NPY的表達,探討丹參多酚酸鹽及NPY干預注射對海馬NPY的表達影響研究,進一步探討內在抗癲癇機制及外在抗癲癇藥物的作用,為癲癇治療提供形態學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性成年Wistra大鼠20只,體重200-250 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將動物置于20℃、安靜的環境中飼養。匹魯卡品(PILO）,美國SIGMA公司;神經肽Y,美國SIGMA公司;兔抗大鼠NPY蛋白質多克隆抗體,武漢博士德公司;SABC免疫組化試劑盒,武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 隨機分為(1）NPY干預組5只,用2%戊巴比妥鈉0.1 m/50 g將大鼠麻醉,立體定位儀上固定,依次切開皮膚、皮下組織,鈍性分離骨筋膜,按大鼠解剖圖譜Fig22取前囟后2.0 mm、左旁開1.0 mm,手術刀鉆開顱骨,校準微量進樣器垂直度后,抽取NPY 10 μ l(即6 nmol）,垂直進針至硬腦膜下3.5 mm(左側腦室）,緩慢注射,于10-15 min內注射完畢,留針2 min后拔出進樣器,撒上青霉素粉防感染,縫合皮膚,放回飼養籠內;第二天腹腔注射匹魯卡品(PILO）350 mg/kg,注入前30 min腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg,以拮抗其外周膽堿能反應,觀察癲癇發作情況。(2）丹參多酚酸鹽干預組5只,同樣方法側腦室注射丹參多酚酸鹽10 mg/kg 1 h后,第二天腹腔注射PILO350mg/kg,注入前30min腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg,以拮抗其外周膽堿能反應,觀察癲癇發作情況。(3）生理鹽水干預組5只,用上述同樣的方法行側腦室注入等量生理鹽水,第二天腹腔注射PILO350 mg/kg,以后觀察有無癲癇發作。(4）對照組5只,大鼠腹腔注射等量的生理鹽水,注入前30 min腹腔注入東莨菪堿1 mg/kg,觀察癲癇發作情況。腹腔注藥后立即觀察大鼠有無癲癇發作,按 Racine[1]制定的標準判定。共觀察12 h。記錄發作時間及次數。

1.2.2 標本處理 實驗動物均于腹腔注藥后立即觀察有無癲癇發作,12 h后用2%戊巴比妥鈉0.1 ml/50 g將大鼠麻醉,獲取標本。步驟如下:在立體定位儀上固定,剪開胸腹腔,暴露心臟、肝臟,取灌注針自心尖向右上45°進針至主動脈起始端。快速灌注生理鹽水100 ml-200 ml后接4%多聚甲醛(PF）200 ml灌注,至大鼠四肢強直、肝臟變白后停止灌注,拔出穿刺針。仔細剪開顱骨,取中腦至小腦之間腦組織,放入4%PF后固定2 h以上,移入30%蔗糖溶液4℃過夜。

1.2.3 冰凍切片 冰凍切片機溫度調至-18～-16℃后,將已沉底腦組織修材,固定于基座上,自中腦向后行20 μ m冠狀連續切片,并放入磷酸鹽緩沖液中用于NPY免疫組化,并都置于4℃冰箱保存備用。

1.2.4 神經肽Y的SABC免疫組織化學染色 組織片飄浮于PBS配制的1%H2O2中,室溫下10 min消化內生過氧化物酶,PBS加0.3%TritonX-100 5 min/次洗1次,PBS 5 min/次洗 2次;室溫下加正常山羊血清封閉抗原20 min;然后加1∶500兔抗大鼠NPY多克隆抗體4℃過夜,PBS加0.3%TritonX-100 5 min/次洗3次;加1∶100生物素化羊抗兔IgG抗體37℃孵育 30 min,PBS加 0.3%TritonX-100 5 min/次洗3次;加1∶200鏈霉素親和素-生物素復合物(SABC）37℃孵育30 min;PBS 5 min/次洗3次,TBS 5 min/次洗1次,0.2%CoCl2中放置10 min,TBS 5min/次洗2次,PBS 5min/次洗3次,DAB避光顯色5-10 min,鏡下觀察至效果滿意,PBS終止反應。貼片干燥經脫水、透明后中性樹膠封片。用PBS取代一抗作陰性對照。置換試驗用正常兔血清代替兔抗大鼠NPY抗體。

NPY陽性細胞計數:在光學顯微鏡下,每組隨機選取6張切片5個高倍視野。計算海馬齒狀回門區、CA3、CA1區每個高倍視野下的NPY陽性細胞數。

1.3 數據分析

所有數據均使用SPSS 13.0軟件進行統計分析。數據表示為ˉx±s。NPY陽性細胞數均數各組間兩兩比較行t檢驗,組間比較行ANOVA方差檢驗,統計顯著性為P＜0.05。

2 結果

2.1 行為學觀察

根據Racine制定的標準判定癲癇發作:0級:無驚厥;Ⅰ級:面部陣攣;Ⅱ級:面部陣攣+節律點頭;Ⅲ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣;Ⅳ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立;Ⅴ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。鹽水干預組5只大鼠在注射PILO后10-20 min均見癲癇發作,而且1 h達到Ⅴ。丹參多酚酸鹽組4只大鼠在注射PILO后30-40 min見癲癇發作,但程度較弱,達到Ⅱ-Ⅲ。NPY干預組有3只大鼠在注射PILO后50-60 min癲癇發作至Ⅱ級。對照組無癲癇發作。

表1 按Racine分級標準的行為學觀察

2.2 NPY免疫組化結果

各組海馬門區、CA3區、CA1區NPY陽性細胞數(見表2）,生理鹽水及丹參多酚酸鹽干預組均可見到顆粒細胞異位表達的NPY。干預方法不同,海馬NPY陽性細胞數表達不同(F=9.853,P＜0.05）。NS、丹參多酚酸鹽干預組NPY陽性細胞數高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05）;丹參多酚酸鹽組高于生理鹽水干預組,差異有統計學意義(P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 NPY陽性細胞數形態(NPY免疫組化染色,×400）

表2 各組 NPY陽性細胞數(±s）

表2 各組 NPY陽性細胞數(±s）

注:干預組各區比較,(F=54.815,F=372.253,F=115.253,P＜0.05）,差異有統計學意義;對照組各區比較(F=52.985,P＜0.05）,差異有統計學意義。

分區 NPY干預組(n=5）NS干預組(n=5）丹參多酚酸鹽干預組(n=5）對照組(n=5）門區 8.320±2.853 20.160±3.216 29.250±4.20110.189±3.204 CA3區 2.381±1.6586.800±1.418 12.135±4.127 3.128±1.148 CA1區 1.726±1.3214.540±2.938 9.651±3.107 2.684±1.0275

3 討論

正常大鼠海馬齒狀回門區、CA1、CA3區有NPY的表達,而且主要在抑制性神經元中表達[2],顆粒細胞中無表達,不能觀察到NPY免疫反應性變化。本研究發現,癲癇發作后海馬齒狀回門區、CA1、CA3區有NPY的表達,且顆粒細胞層有NPY的異位表達(NPY-IR）。有研究發現[3],癲癇發作后NPY-IR明顯增多,可能是以下兩方面的原因,一是由于NPY的生物合成增多,二是由于NPY的釋放減少。在NPY-IR增強的同時相應的細胞內的NPY-mRNA也增多,從而提示NPY的生物合成增強。在致大鼠癲癇的所有模型中,在大鼠腦內海馬苔蘚纖維的病理改變中發現,無論急性期、靜止期,還是慢性期,NPY在整個發作過程中持久表達[4]。研究發現[5],內源性神經肽Y在調控興奮性上起著重要作用,癲癇大鼠模型中海馬NPY的含量與癲癇的發作程度和發作形式相關。發作程度越重,NPY的表達增多。這有可能與機體抵抗癲癇的的發作而代償性增加有關。一般情況下,癲癇發作后激發機體產生NPY,本實驗中側腦室注入外源性NPY后,在腹腔注射PILO后癲癇發作程度明顯減輕或是無癲癇發作,所以NPY表達減少,且海馬區NPY陽性細胞數明顯低于鹽水干預組,差異有統計學意義(P＜0.05）。提示NPY有直接抗癲癇作用。本研究顆粒細胞層無NPY的異位表達,支持癲癇發作后顆粒細胞層NPY的表達不是藥物或者細胞損傷的結果,而是由癲癇活動激發的結果。表明癲癇發作后海馬內NPY的增加是一種代償性的抗癲癇作用。Woldbye[6]研究中觀察戊四氮致癇大鼠一側側腦室注射NPY后,明顯延長了癇性發作的潛伏期,并降低了死亡率。另有研究也證實[7],側腦室注入NPY可顯著縮短癲癇發作時間及程度。

[1]Racine RJ,Gartner JG,Burnham WM.Epileptiform activity and neural plasticity[J].Epilepsia,2005,46(5）:452.

[2]Cabrele C,Beck-Sickinger AG.Molecular characterization of the ligandreceptor interaction of the neuropeptide Y family[J].J-Pept,2000,6(3）:97.

[3]Schwarzer G,Kofler N,Sperk G,et al.Up-regulation of neuropeptide YY2 receptors in an animal model of temporal lobe epilepsy[J].Mol.Pharmacol,1998,53(1）:6.

[4]Boeck,Carina R-Ganzella,Marcelo.NMDA preconditioning protects against seizures and hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic acid in mice[J].Epilepsia,2004,45(7）:745.

[5]Williams PA,Don P,Dudek F,et al.Epilepsy and synaptic reorganization in a perinatal rat model of hypoxia-ischemia[J].Epilepsia,2004,45(10）:1210.

[6]Woldbye DPD.Antiepileptic effects of NPY on pentylenetetrazole seizures[J].Regul Pept,1998,75-76:279.

[7]段瑞生,金 善,遲兆富.腦室內灌注神經肽Y對戊四氮致癇大鼠海馬內腦源性神經生長因子表達的影響[J].腦與神經疾病雜志,2002,1095）:275.