薯蕷皂苷元誘導人胃低分化粘液腺癌MGC-803細胞凋亡依賴caspase-3途徑

何忠梅,張顯濤,王鐵成

(1.吉林農業大學,吉林長春 130118;2.修正藥業集團長春高新制藥有限公司;3.吉林天藥科技有限公司）

薯蕷皂苷元(Diosgenin,Dio）是從我國特有的薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino中分離得到的一種植物甾體化合物,具有降血脂[1]、降血糖[2]、促進膽汁分泌[3]、抗血栓[4]、抗心肌缺血[5]、抗風濕[6]、抗炎[7]等作用,而它的抗腫瘤作用[8-10]更是引起了研究者的極大關注。Dio能夠誘導人紅白血病細胞和人白血病細胞分化和凋亡[11],誘導人骨肉瘤細胞凋亡和人黑色素瘤細胞凋亡[12],具有明顯抑制移植胃低分化粘液腺癌(MGC-803）荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用[13],Dio還能明顯抑制MGC-803細胞的分裂和集落形成[14],能引起其形態改變并影響其DNA的合成[15],而關于Dio是否能誘導MGC-803細胞凋亡及其凋亡途徑的研究,至今尚未見報道。本實驗主要在離體條件下,探討Dio對MGC-803細胞的促凋亡作用及caspase-3對凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器與試劑

MGC-803細胞株購自吉林省腫瘤醫院。CK2TRC-3熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司）;D-63450-CO2培養箱(Hera公司）;FCANF129004酶標儀(TECAN公司）;流式細胞儀(BD公司）;96孔培養板和培養瓶(NUNCTM）;RPMI-1640培養基(Hyclone）;新生牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所）;Annexin V-FITC和APO-BRDU細胞凋亡檢測試劑盒、四唑藍(MTT）、Ac-DEVD-CHO和 A-DEVD-AFC均為Sigma公司產品。Diosgenin亦為Sigma公司產品,用無水乙醇和二甲基亞砜配制成高濃度溶液備用,二者的終濃度均低于0.1%。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 按常規方法培養傳代,取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞生長抑制實驗 以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中,培養12 h后加入diosgenin濃度分別為 0,1.875,3.75,7.5,15,30,60 μ g?ml-1,分別于0,24,48,72 h用MTT方法測定細胞死亡率。或者在加入 caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO 60min后,再加入不同濃度的diosgenin。

1.2.3 Annexin V-FITC檢測凋亡早期細胞 按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4 APO-BRDU檢測凋亡晚期細胞 按照APOBRDU Kit說明書操作。

1.2.5 Caspase-3活力測定 將細胞接種到培養瓶中,培養12 h后加入diosgenin濃度分別為0,15,30 μ g?ml-1,24 h 后收集細胞 ,加入 100 μ l裂解液重懸細胞,冰浴10 min。12 000 rpm,4℃,3 min沉淀細胞碎片。上清液轉至另一新管中,加入100 μ l 2×反應buffer,加 入 A-DEVD-AFC 使其 終濃 度為 50 μ M,混勻,37℃,60 min水浴后轉移至不透光96孔板中,酶標儀(Ex=400 nm,Em=505 nm）測定熒光。結果以給藥組的熒光與對照組的熒光的比值表示即F(treatment）/F(control）,簡稱 F(t）/F(c）。

2 結果

2.1 Dio對MGC-803細胞增殖的影響

Dio對MGC-803細胞增殖的抑制作用呈明顯的時-效和量-效關系。隨著Dio濃度的增加,作用時間的延長,其殺傷MGC-803細胞的能力也隨之增強。經SPSS軟件統計,用直線回歸方程計算其作用24、48、72 h IC50值為 56.290、27.837、17.723 μ g?ml-1。當 diosgenin 達到較高濃度(30、60 μ g?ml-1）時,對MGC-803細胞的增殖抑制作用在48和72 h已十分接近,因此,48 h高濃度Dio已基本發揮較大效用。

2.2 Annexin V-FITC檢測Dio處理后的凋亡早期細胞

細胞漿膜不對稱性喪失導致磷脂酰絲氨酸(PS）外翻是細胞凋亡的早期過程,Annexin V可與PS特異性強烈結合,被用來檢測細胞早期凋亡。Annexin V-FITC+/PI-雙標檢測可見,與陰性對照組比較,隨著作用濃度的不斷提高,Dio組凋亡細胞呈劑量依賴性增多,結果見表1。

表1 通過Annexin V-FITC檢測Dio是否誘導MGC-803細胞發生早期凋亡

2.3 APO-BRDU檢測Dio處理后的凋亡晚期細胞

核酸內切酶活化是凋亡晚期細胞的一個特征變化,活化的內切酶將DNA斷裂成不連續的、不同倍數的180-200 bp的小核酸片段。這是目前判斷細胞凋亡的一項重要生化指標,這種凋亡細胞的DNA斷裂碎片,可以通過APO-BRDU試驗進行檢測。實驗結果顯示,隨Dio劑量增大,DNA斷裂碎片增多,凋亡細胞逐漸增多,當Dio濃度達到60 μ g/ml時,凋亡細胞百分數已由陰性對照組的1.48%增至30.08%,見表2 。

2.4 Dio對MGC-803細胞中caspase-3活性的影響

Caspase-3被認為是凋亡的執行者,在腫瘤細胞凋亡中起著十分重要的作用。結果顯示,15、30 μ g/ml Dio作用MGC-803細胞24 h后,MGC-803細胞中caspase-3活性顯著增加(見圖1）。隨Dio作用濃度的增大,caspase-3活性也隨之增強。

表2 通過APO-BRDU檢測Dio是否誘導MGC-803細胞發生晚期凋亡

圖1 Dio對MGC-803細胞中 caspase-3活性的影響

2.5 Caspase-3特異性抑制劑DEVD-CHO對Dio誘導MGC-803細胞死亡的影響

15 μ g/mL Dio 作用MGC-803 細胞 24 h,對細胞的生長抑制率為46.91%,而先用DEVD-CHO預處理細胞1 h后再用Dio作用細胞,其對細胞生長的抑制率已降為18.79%(見表3）。實驗結果提示,caspase-3抑制劑DEVD-CHO能阻斷Dio誘導MGC-803細胞死亡。

表3 DEVD-CHO對Dio抑制MGC-803細胞生長的影響

3 討論

從天然產物中尋找活性成分,已經成為當今抗腫瘤藥物發展戰略之一。Dio是從天然中草藥薯蕷科植物中提取的抗腫瘤活性成分。在對Dio進行抗MGC-803細胞作用機制的研究中,我們用AnnexinVFITC試劑盒檢測到了凋亡細胞早期的變化即細胞漿膜不對稱性喪失導致磷脂酰絲氨酸(PS）外翻,在APO-BRDU分析中,檢測到凋亡細胞斷裂的DNA碎片,證實了Dio誘導人胃低分化粘液腺癌MGC-803細胞凋亡。

藥物誘導細胞凋亡的分子機理十分復雜,許多基因的變化參與此過程,但經典途徑是caspases途徑。為進一步探討Dio誘導凋亡的機制,我們主要考察了caspase-3在此過程中的作用。實驗結果表明,Dio能激活MGC-803細胞中的caspase-3,增強caspase-3活力,caspase-3特異性抑制劑DEVD-CHO能阻斷Dio誘導MGC-803細胞死亡的作用,證實Dio誘導MGC-803細胞凋亡依賴于caspase-3途徑。

霍銳等人報道Dio未導致人黑色素瘤細胞A375-S2中caspase-3活力升高[14],而我們的實驗證明Dio能激活MGC-803細胞中的caspase-3,增強caspase-3活力,說明Dio通過不同途徑誘導不同腫瘤細胞發生凋亡。

雖然我們的實驗證明Dio誘導MGC-803細胞凋亡依賴于caspase-3的激活,但如何激活caspase-3還不清楚。caspase-3主要位于整個信號傳導的下游,caspase-8和caspase-9均位于其上游,Dio誘導MGC-803細胞凋亡具體是通過caspase-8介導的死亡受體途徑還是caspase-9介導的線粒體途徑,還有待于進一步探討。

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