羥基磷灰石納米顆粒對骨肉瘤MG63抑制作用的體外實(shí)驗(yàn)研究

馮 衛(wèi),付 莉,李冬松,劉建國*

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院）

納米羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP）作為一種新型生物醫(yī)用材料,正在成為骨組織工程研究的熱點(diǎn),用于骨缺損的治療研究。研究表明納米羥基磷灰石可以作為藥物載體,先前研究表明納米羥基磷灰石對正常細(xì)胞沒有抑制作用[1],而體外實(shí)驗(yàn)可以抑制胃癌、喉癌腫瘤細(xì)胞[2,3]。但是對骨肉瘤的作用還不十分清楚,本研究的目的是觀察納米羥基磷灰石粒子對骨肉瘤細(xì)胞MG63的作用,探討其抑制腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料羥基磷灰石納米粒子由四川大學(xué)分析測試中心提供,長徑為60-80 nm,直徑為10-20 nm。骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞株由四川大學(xué)華西移植免疫實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司）,小牛血清(HyClone公司）,丫啶橙(AO）、溴化已啶(EB）及胰蛋白酶均購自Sigma公司。

1.2 MG63細(xì)胞培養(yǎng)MG 63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,每4天按1∶3比例傳代。

1.3 MTT法檢測不同濃度HAP納米粒子對MG63生長的抑制率分別將HAP納米粒子用培養(yǎng)液配制成10、20、50、100、150、200、250、300、350、400mg/L 10種濃度。將MG63細(xì)胞按1×103/孔接種于96孔板中,每孔加入培養(yǎng)基180μ l,于 37℃、5%CO2 下培養(yǎng)24 h后仔細(xì)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,分別加入上述不同濃度的HAP納米粒子,對照組加入等量培養(yǎng)液,每濃度重復(fù)4孔。48 h后進(jìn)行MTT法檢測,酶標(biāo)儀檢測各孔OD值(λ=492 nm）,記錄結(jié)果,計(jì)算每種HAP濃度對細(xì)胞的抑制率。并計(jì)算30%抑制濃度(30%Inhibiting concentration,IC30）,50%抑制濃度(IC50）和70%抑制濃度(IC70）。抑制率=100%×(試驗(yàn)組OD值-對照組OD值）/對照組OD值

1.4 IC30、IC50、IC70濃度HAP對MG63生長抑制作用的時(shí)效曲線 將MG 63細(xì)胞接種于96孔板中,每孔接種1×103個(gè)細(xì)胞,24 h后隨機(jī)分為IC30組、IC50組、IC70組和空白對照組,每組24孔。分別加入IC30、IC50、IC70 3種濃度HAP,空白對照組加入培養(yǎng)液。隨后每天每組4孔MG63細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測,重復(fù)6天。按照上述公式計(jì)算抑制率,繪制這3種濃度HAP對MG63抑制作用時(shí)效曲線。

1.5 AO/EB染色觀察HAP作用后MG63細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 接種MG63細(xì)胞于6孔板中,24 h后加入IC50濃度的HAP,對照組加培養(yǎng)液。48 h后棄培養(yǎng)液,加入含AO/EB(濃度為100 mg/L）的培養(yǎng)液,熒光顯微鏡觀察HAP作用后MG63細(xì)胞的形態(tài)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析收集經(jīng)IC 50濃度的HAP作用48 h的細(xì)胞和對照組細(xì)胞,每組10個(gè)標(biāo)本,用預(yù)冷的70%乙醇固定48 h,離心后棄上清,PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/ml,RNA酶消化,50 mg/L PI染色,流式細(xì)胞儀檢測,Multicycle軟件分析各細(xì)胞周期比例,亞二倍體峰G1法分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。計(jì)量資料采用(±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同濃度HAP納米粒子對MG63生長的抑制率 濃度在0-400 mg/L范圍內(nèi)變化時(shí),HAP對MG63均有不同程度抑制作用,見表1。當(dāng)HAP濃度低于150 mg/L時(shí),隨著藥物濃度增大,對細(xì)胞抑制率明顯增加,10、20、50、100 mg/L這4種濃度的抑制率之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05。當(dāng)HAP濃度大于150 mg/L后,抑制率不再明顯增加,進(jìn)入平臺(tái)期,各濃度的抑制率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＞0.05。根據(jù)內(nèi)插法計(jì)算 IC30、IC50、IC70分別為12.50 mg/L、39.10 mg/L和 86.31 mg/L。

表1 不同濃度HAP納米粒子對MG63的抑制作用(λ=492nm）

2.2 IC30、IC50、IC70濃度HAP對MG63生長抑制作用的時(shí)效曲線 見圖1,這3種濃度HAP對MG63的抑制作用均隨時(shí)間的延長而增加,在3天內(nèi)抑制率的增長快,而在3天之后,增加速度明顯減慢,表明HAP納米粒子對MG63生長抑制作用主要發(fā)生在3天內(nèi)。

2.3 AO/EB染色觀察HAP作用后MG63細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 正常對照組的細(xì)胞數(shù)量較多,生長良好,而HAP作用后的細(xì)胞數(shù)量減少,凋亡細(xì)胞較多,凋亡細(xì)胞早期表現(xiàn)為細(xì)胞核呈濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片,晚期表現(xiàn)為核碎裂呈濃染的紅色碎片。

圖1 HAP納米粒子作用于MG63的時(shí)效曲線

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析HAP組的細(xì)胞凋亡率為19.03±5.80,正常對照組為12.32±3.84,兩組間差異顯著(P＜0.05）。HAP組G0/G1期細(xì)胞顯著增多,S期細(xì)胞顯著減少,同正常對照組相比兩組間差異顯著(P＜0.05）。

3 討論

納米羥基磷灰石(HAP）由于顆粒尺寸的細(xì)微化使比表面積急劇增加的特點(diǎn),具備和普通羥基磷灰石粒子不同的理化性能,如溶解度高、表面積大、生物活性更好等,且近年來的研究發(fā)現(xiàn)納米HA有抗肝癌和舌癌等作用[4,5],其抗癌普廣、作用溫和,還可以作為藥物載體用于疾病治療,是一種生物相容性更好的治療材料。

將HAP納米粒子與MG63共培養(yǎng)進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HAP納米粒子在不同濃度范圍變化時(shí),對MG63有不同程度的抑制作用生長,當(dāng)濃度低于150 mg/L時(shí),隨著藥物濃度的增大,對細(xì)胞的抑制率明顯增大,呈量效依賴關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)最初的3天內(nèi)HAP對MG63的生長抑制率明顯增加,3天后生長抑制率減慢并進(jìn)入平臺(tái)期,結(jié)果表明HAP對MG63的生長抑制敏感期在3天內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示選定IC50濃度為39.10 mg/L的HAP納米粒子進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

目前對HAP納米粒子對腫瘤細(xì)胞的抑制作用機(jī)理還不十分清楚,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療惡性腫瘤的一條有效途徑。Bauer[6]研究發(fā)現(xiàn)小于100 nm的針狀HAP納米粒子具有較低的結(jié)晶度和較高的表面活化能,當(dāng)HAP納米粒子與癌細(xì)胞表面接觸,HAP納米粒子是以能量依靠型網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞噬作用方式進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。Chen等[7]認(rèn)為由于腫瘤細(xì)胞的吞噬能力較強(qiáng),納米粒子以非受體介導(dǎo)的直接吞噬方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部,與線粒體、溶酶體或高爾基體等結(jié)合發(fā)生化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致溶酶體破裂或釋放各種酶,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。其研究發(fā)現(xiàn)納米HAP可以顯著降低腫瘤細(xì)胞活性,誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡,活化Caspase-3和Caspase-9。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)HAP納米粒子的抗癌活性和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力與粒子的大小密切相關(guān),粒子在20-80 nm范圍內(nèi)可以有效激活caspase-3和Caspase-9,降低Bcl-2蛋白水平,同時(shí)增加Bax蛋白表達(dá)和細(xì)胞色素C的釋放[8]。本研究所制備的HAP納米粒子長徑約為60-80 nm,直徑約為10-20 nm,我們推測HAP納米粒子可能通過腫瘤細(xì)胞的直接吞噬作用后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,與DNA結(jié)合并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)HAP作用過的MG63細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面出現(xiàn)凋亡特征,細(xì)胞核濃縮,細(xì)胞核發(fā)生碎裂和濃染,結(jié)果提示HAP可能損傷DNA,誘導(dǎo)MG63細(xì)胞的凋亡。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析了HAP組細(xì)胞的凋亡率(19.03±5.80）%,明顯高于對照組。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)HAP組的S期細(xì)胞明顯少于對照組,而G0/G1期細(xì)胞明顯多于對照組,因此認(rèn)為HAP納米粒子對腫瘤細(xì)胞的作用可能具有細(xì)胞周期特異性,作用于細(xì)胞的S期,損傷DNA鏈、阻止DNA的合成、復(fù)制,導(dǎo)致S期細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞不能繼續(xù)進(jìn)入G2期,最終不能完成細(xì)胞分裂和增殖。

綜上所述,HAP納米顆粒對MG63有明顯的抑制作用,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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[5]陳超,王慧明.納米羥基磷灰石溶膠對人舌癌細(xì)胞株的作用研究[J].實(shí)用腫瘤雜志,2003,18(6）:459.

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[7]Chen X,Deng C,Tang S,et al.Mitochondria-dependent apoptosis induced by nanoscale hydroxyapatite in human gastric cancerSGC-7901 cells[J].Biol Pharm Bull,2007,30(1）:128.

[8]Yuan Y,Liu C,Qian J,et al.Size-mediated cytotoxicity and apoptosis of hydroxyapatite nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells[J].Biomaterials,2010,31(4）:730.