蛋白酶抑制劑MG132在聯合NGF誘導PC12細胞分化過程中的作用及機制

王曉明,盧 偉,丁 軍

(臺州學院醫學院解剖與組織胚胎學教研室,浙江臺州318000;吉林大學第三臨床醫院放射科,吉林長春 130033）

神經細胞突起的形成是神經系統發育的一個重要過程,這個過程主要受神經營養因子(neurotrophic cytokine）,如神經生長因子(nerve growth factor,NGF）的調控。NGF可誘導神經細胞長出突起,其機制是通過活化其特異性受體,酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor,TrkA）,使其磷酸化,從而激活了胞內的受TrkA調控的一系列的胞內信號通路完成的[1-3],如胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen activated protein kinase,ERK/MAPK）通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K/AKT）途徑[4,5],且誘導與TrkA的磷酸化時效有關[6,7]。

泛素(ubiquitin,UB）是一種存在于大多數真核細胞中的小蛋白。它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質,當附有泛素的蛋白質接觸到蛋白酶時,蛋白酶就會將該蛋白質水解。泛素也可以標記跨膜蛋白,如受體,將其從細胞膜上除去。最新研究報道稱,TrkA受體在與NGF結合的過程,可以被NGF泛素化(ubiquitinated）,而且泛素化過程可以調節活化TrkA受體胞外域由細胞的表面轉移至胞內(簡稱內化）以及TrkA介導的信號通路[8-10]。外有報道稱NGF在誘導神經細胞突起產生的過程中伴有內源性泛素和泛素化蛋白(ubiquitinated proteins）水平的升高[11]。目前雖已證實蛋白酶抑制劑可以誘導神細胞產生突起以及增強少突膠質細胞分化的作用[12-14],具體機制仍未明晰的,而且作用效果較弱[15],且有報道稱高濃蛋白酶抑制劑對神經細胞有細胞毒效應[16]。在本實驗中我們選用了一種常見的蛋白酶抑制劑,MG132,探討蛋白酶抑制MG132在聯合NGF誘導PC12細胞分化中的作用,并分析其誘導機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

蛋白酶抑制劑MG132,購自Sigma公司,美國;NGF(商品號ab105059）及抗體:抗TrkA胞外域抗體(商品號ab8871）,抗泛素抗體(商品號ab8134）,抗Phospho-TrkAY490抗體(商品號ab1445）,抗TrkA抗體(商品號 ab76291）,FITC熒光標記物(商品號ab8030）,均購自 Abcam生物試劑公司,上海。DMEM、馬血清(商品號S9050）、牛血清白蛋白(BSA,商號號A8010）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司,上海。

1.2 PC12細胞的獲得、培養及分組

PC12細胞(購于中國科學院上海細胞所）,接種在培養瓶內,培養基為高糖Dulbecco的改良Eagle的培養基(DMEM,Gibco,上海索萊寶生物科技有限公司）,添加10%馬血清,5%BSA,37℃,5%CO2細胞培養箱內培養。生長狀態良好的PC12細胞,胰酶消化、離心,調細胞濃度1×105個/ml,并接種到多聚賴氨酸包被6孔培養板中。

實驗分2組:Group I:NGF單獨誘導組,培養體系內加終濃度為50 ng/ml的NGF;Group II:NGF與MG132聯合誘導組,培養體系內加50 ng/ml的NGF、0.5-20 μ mol/L 的 MG132 。

1.3 不同條件誘導下PC12細胞分化的評判

各組PC12細胞均于誘導4 h后,顯微攝影,計數鏡下1 000個細胞,并計數其中陽性細胞(有突起生出的細胞）數量,評判不同誘導條件下的陽性細胞生成率。陽性細胞的評定標準為,細胞具有突起,且突起中至少有一根長度超過該細胞的一個胞體直徑。

1.4 Western blot分析

各組細胞經胰酶消化,并經冷的0.01mol/LPBS緩沖液洗 3次,離心收集,加細胞裂解液(50 mM Tris-Cl,pH7.4,150 mM NaCl,5%NP-40,1mM sodium pyrophosphate,2 mM EDTA等）裂解細胞(1 ml細胞壓積加入6-10 ml裂解液）,輕輕吹打混勻,離心15 min,12 000轉,取上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質總量,操作步驟按說明書進行。各組均取等量的蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳,凝膠轉膜,轉移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色,檢測TrkA受體的磷酸化水平及泛素蛋白表達?？贵w為:抗泛素抗體,抗Phospho-TrkAY490抗體,抗TrkA抗體。

1.5 流式細胞術分析

各組細胞在誘導0,15,30和60 min后,用細胞分類緩沖液洗兩次(內含0.5%BSA,0.05%疊氮鈉,1 mM MgCl2,1 mM CaCl2）,抗TrkA胞外域抗體孵育45 min;細胞經細胞分類緩沖液再洗,FITC熒光標記物孵育30 min。細胞分類緩沖液再洗,流式細胞儀檢測被熒光標記的細胞數,用于檢測TrkA受體的退化及胞外域的內化程度。

2 結果

2.1 NGF及MG132誘導PC12細胞突起生成

由于MG132是蛋白酶抑制劑中的一種。文獻報道蛋白酶抑制可誘導PC12細胞分化,尤其是對神經細胞生出突起具有一定的誘導作用。但具有一定的細胞毒性[16-18,26]。由于不確定在體外培養時,MG132的最佳誘導濃度,我比較了8個梯度(0.1 μ M,0.25 μ M,0.5 μ M,1 μ M,5 μ M,10 μ M,15 μ M 和 20 μ M）的MG132單獨誘導下PC12細胞的分化情況。結果顯示MG132誘導PC12細胞分化 24 h后,在8組中,以0.5 μ M組陽性細胞最多,陽性率為14.3%。MG132濃度大于10 μ M時,細胞大量死亡。因此在后續實驗中MG132的濃度均選用為0.5 μ M,如圖1。

圖1 不同濃度的MG132聯合NGF對PC12細胞分化的誘導比較

NGF單獨誘導時,結果顯示具有相似的有突起細胞生成率,約12%。當聯合0.5μ M的MG132作用后,約有18%的細胞長出了突起(如圖2）。結果顯著高于NGF單獨誘導。這提示聯合誘導時,MG132可強化NGF對PC12細胞突起生成的誘導。

2.2 蛋白酶抑制劑MG132對TrkA受體的磷酸化的影響

圖2 MG132聯合NGF誘導PC12細胞生出突起

流式細胞術(抗體為抗TrkA抗體）檢測了活化TrkA受體退化的情況。結果,當NGF單獨誘導時,TrkA受體在初始的15-20 min內表達呈持續高表達,隨后下降,1 h后并逐漸降至未誘導前水平;當NGF聯合MG132誘導時,TrkA呈在初始的1 h內均呈上高表達,隨后下降,3 h后逐漸降至未誘導前水平(圖3）。Western blot方法檢測了TrkA受體的磷酸化水平(抗體為抗Phospho-TrkAY490抗體）。(圖4）結果顯示,在NGF或NGF聯合MG132誘導條件下,TrkA受體都可發生磷酸化。但NGF單獨誘導時,TrkA受體的磷酸化水平持續的時間明顯短于NGF聯合MG132誘導時,結果與流式細胞術檢測的結果一致。這提示聯合誘導時,MG132可延長TrkA受體的磷酸化水平,穩定活化的TrkA受體,使之延緩退化。

圖3 不同誘導條件下,TrkA受體的退化與內化

2.3 蛋白酶抑制劑MG132可影響TrkA受體胞外域的內化

流式細胞術檢測胞外域的內化情況(抗體為抗TrkA胞外域抗體）。結果顯示NGF單獨誘導時,15 min時,有21.16%的細胞發生了內化(TrkA胞外域抗體陽性表達率78.84%）,30min時,為68.79%,1h時,已近乎100%完全內化(為94.95%）。當MG132聯合NGF誘導時,在相同時間點上,內化率明顯增加(圖3）。這提示MG132可加速活化的TrkA受體胞外域的內化進程。

2.4 泛素在TrkA受體的穩定中的作用

Western blot方法檢測了在不同誘導條件下的PC12細胞內的泛素水平(抗體為抗泛素抗體）。結果顯示,NGF單獨誘導時,PC12細胞內泛素蛋白的表達水平較高,當NGF聯合MG132誘導后,PC12細胞內泛素蛋白的表達水平下降(圖3）。

圖4 Western blot檢測不同條件誘導下,TrkA受體的退化與內化及泛素蛋白表達水平

3 討論

TrkA是NGF的特異性受體,NGF通過與之結合可誘導神經細胞分化,特別是對神經細胞生出突起的誘導。誘導效果與TrkA的磷酸化時效呈正相關[4,5]。TrkA是一種跨膜受體,有三個域,分別為胞外域、跨膜域和胞內域[17]。當配體NGF與受體TrkA的胞外域結合后,TrkA活化:胞內域磷酸化;胞外域逐漸由細胞的表面轉移至胞內。胞外域的內化將導TrkA受體退化[17]。

在本實驗中我們嘗試NGF與蛋白酶抑制劑MG132聯合誘導PC12細胞分化,結果顯示,MG132可強化NGF對PC12細胞分化的誘導。由于NGF誘導神經細胞分化的機制與TrkA受體活化有關,我們隨后進一步探討了MG132在強化NGF誘導PC12細胞分化的過程是否亦與TrkA受體活化有關。由于活化的TrkA受常呈現不穩定現象,短時間很快即退化[5]。我們流式細胞術檢測了TrkA受體退化的情況,結果MG132可顯著的延緩活化的TrkA的退化,而且亦可延長TrkA受體胞內域的磷酸化(Western blot方法檢測TrkA受體的磷酸化水平）。這提示聯合誘導時,MG132可延長TrkA受體的磷酸化水平,穩定活化的TrkA受體,使之延緩退化。

由于活化的TrkA受體的退化常與胞外域的內化有關[8-10]。為了進一步明晰蛋白酶抑制劑MG132延緩活化的TrkA受體退化的機制,我們采用流式細胞術檢測了胞外域的內化情況。結果顯示出人意料的是MG132并沒如期望的那樣延緩胞外域的內化,反而加速了內快的進程。這提示MG132阻抑活化TrkA的退化并不是通過阻抑胞外域的內化進程完成的。

有報道稱NGF活化TrkA受體的同時,亦使之泛素化。泛素化是誘導活化TrkA受體退化另一條重要途徑[8-10]。既然MG132強化NGF對PC12細胞分化的誘導并不是通過阻抑胞外域完成的,那么極有可能通過影響TrkA受體的泛素化進程來完成。我們用Western blot方法檢測了誘導后的PC12細胞內泛素蛋白的表達量,結果顯示NGF單獨誘導時,PC12細胞內的泛素水平較高,當NGF聯合MG132誘導后,PC12細胞內的泛素水平下降。

總之,蛋白酶抑制劑MG132可有效的強化NGF對PC12細胞的誘導作用;其機制與TrkA受體有關:MG132能加快TrkA受體胞外域的內化進程;延長TrkA受體磷酸化時間,使活化的TrkA受體保持穩定;這種穩定可能與抑制泛素蛋白過量表達有關。具體機制還有待于進一步探討。

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