東菱迪芙和依達拉奉聯合應用對大鼠急性期腦缺血損傷的研究

全銀實,姜美子,金美善,崔玉珍,李香美,朱恩波

(1.丹東市第1醫院 神經內科,遼寧 丹東 118000;2.延邊大學附屬醫院 神經內科,吉林 延吉 133000）

腦血管病是神經系統常見病和多發病,是目前人類疾病三大死亡原因之一。缺血性腦血管病占腦血管疾病的87%。急性期腦梗死病灶由中心壞死區及周圍的缺血半暗帶組成。壞死區由于完全性缺血導致腦細胞死亡,但缺血半暗帶仍存在側支循環,尚有大量可存活的神經元,保護這些可逆性損傷神經元是急性期腦梗死治療的關鍵。本次實驗通過腹腔注射東陵迪芙與依達拉奉,觀察大鼠局灶性腦缺血損傷前后hs-CRP及D-二聚體水平的變化及神經行為評分,闡明聯合應用東菱迪芙與依達拉奉對急性腦缺血損傷的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠50只(體重200±50g）,由延邊大學實驗動物中心提供。大鼠分為正常組、腦缺血組、東菱迪芙組、依達拉奉組、聯合用藥組。用線栓法[1,2]制作大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,依達拉奉注射液(吉林省輝南長龍生化藥業股份有限公司）,東菱迪芙注射液(北京托畢西藥業有限公司）、hs-CRP試劑盒(德國羅氏診斷有限公司）,）D-二聚體試劑盒(日本東亞希森美康公司）,尼龍線(東莞市佳合線帶廠）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血模型的制作 用線栓法制作大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。用10%水合氯醛(3 ml/1 kg）腹腔注射,約5 min后開始麻醉起效,持續時間約1.5h。仰臥位固定,術區用碘伏消毒。沿頸部正中線切開皮膚,鈍性剝離頜下腺,在左側的肩胛骨舌骨肌、胸骨舌骨肌之間用眼科用鑷鈍性剝離出左側頸總動脈(common carotid artery,CCA）及其分支頸外動脈(external carotid artery,ECA）和頸內動脈(internal carotid artery,ICA）,避免損傷迷走神經、氣管和頜下腺體背面的靜脈竇。首先用6—0縫合線結扎頸總動脈分叉處下方約1cm處,將頸外動脈在分支出枕動脈和甲狀腺上動脈處以6—0縫合線結扎,游離出ECA主干;分離出ICA并穿一套線。解剖顯微鏡下用眼科剪在CCA接近ECA與ICA分叉處剪一小口,將尼龍線栓(尼龍線前端涂上一層硅樹脂,使其變粗,直徑0.25-0.30 mm）[1,2]沿切口插入至頸內動脈約18 mm左右[3,4],當感到阻力時向后退回約1 mm,此時線栓頭端已通過大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion reperfusion,MCA）根部,阻斷了左側MCA血流。用6—0縫合線結扎頸內動脈,剪斷血管外的線栓。將頜下腺歸位,縫合皮膚。腦缺血30分鐘后腹腔內注射生理鹽水3 ml/kg(A組）,腦缺血0.2 h后腹腔內注射東菱迪芙4 BU/kg(B組、D組）,腦缺血0.5 h、6 h后腹腔內注射依達拉奉3 mg/kg/次(C組、D組）。

1.2.2 神經功能評分 缺血2 h,24 h后按照Longa EZ[1]法進行神經行為評分。0分:無神經損傷體征;1分:不能充分伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾斜;4分:不能自主行走,意識喪失。

1.2.3 猝死大鼠及測定hs-CRP及D-二聚體 腦缺血24 h后用10%水合氯醛(3 ml/kg）腹腔注射,約5 min后剖胸,用5 ml注射器刺入左心室,抽新鮮血5 ml左右。常規方法采用CA7000全自動血凝分析儀進行D-二聚體定量檢測。hs—CRP濃度采用免疫比濁法,用全自動生化儀測定,嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,數據以均數±標準差表示,組間采t檢驗比較,P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 神經行為評分

見表1。

表1 Wista大鼠的神經行為評分(±s,n=10）

表1 Wista大鼠的神經行為評分(±s,n=10）

注 ▲與腦缺血組比較有統計學差異(P＜0.05）,●與依達拉奉組比較有統計學差異(P＜0.05）,★與東菱迪芙組比較有統計學差異(P＜0.05）。

組別 缺血2 h后 缺血24 h后腦缺血組(B組） 2.70±0.95 2.90±0.73東菱迪芙組(C組） 2.20±1.03▲ 1.40±0.84▲●依達拉奉組(D組） 2.50±1.08 2.10±0.99▲聯合用藥組(E組） 2.30±0.95▲ 1.00±1.05▲●★

2.2 Wista大鼠的血漿D-二聚體與血清hs-CRP的測定

見表2。

表2 Wista大鼠的D-二聚體與 CRP測定(±s,n=10）

表2 Wista大鼠的D-二聚體與 CRP測定(±s,n=10）

注:▲與腦缺血組比較有統計學差異(P＜0.05）,●與依達拉奉組比較有統計學差異(P＜0.05）,★與東菱迪芙組比較有統計學差異(P＜0.05）。

D-二聚體(μ g/L） CRP(mg/L）A組 86.41±6.91 0.67±0.57 B組 2270.18±246.76 1.09±0.72 C組 389.37±40.84▲● 0.87±0.59 D組 569.89±96.91▲ 0.95±0.43 E組 284.20±26.90▲●★ 0.78±0.36

3 討論

目前為止腦血管病導致的腦缺血損傷的機制除能量耗竭、興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAA）毒性作用、梗死灶周圍半暗帶去極化外,還包括炎性細胞因子、一氧化氮(nitric oxide,NO）和自由基損傷及細胞凋亡等[5]。同時,機體也存在內在的自身保護機制,如血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO）作用產物及腦紅蛋白(Ngb）的腦保護作用。急性期腦梗死病灶由中心壞死區及周圍的缺血半暗帶組成[2]。壞死區因完全性缺血導致腦細胞死亡,但缺血半暗帶仍存在側支循環,尚有大量可存活的神經元。目前國內外研究人員從靜脈溶栓治療到介入微創治療,力求恢復腦缺血區血液供應,保護受損神經細胞。但因“時間窗”的限制,實際上只有極少數患者能及時接受溶栓治療,而且其帶來的副作用再次給患者帶來極大的痛苦,因此更有效、安全地保護這些可逆性損傷神經元是急性腦梗死治療的關鍵。

本實驗對急性腦缺血大鼠用東菱迪芙與依達拉奉處理后,進行神經行為評分及腦缺血損傷標記物D—二聚體的檢測,證明了東菱迪芙通過降低纖維蛋白原降解產物D—二聚體水平,對急性腦梗死起神經元保護作用及改善神經癥狀。

東菱迪芙是絲氨酸蛋白酶的單成分制劑,為新型強力單成分溶血栓微循環制劑。具有降低血纖維蛋白原濃度,增強纖溶系統活性,改變血流流變學方面諸因素以及減少血栓形成等作用。依達拉奉作為一種新型的、強效的羥自由基清除劑及抗氧化劑,可抑制脂質過氧化反應,減輕腦水腫,也能防止氧化性細胞損害,減少缺血半暗帶區的面積,抑制遲發性神經元損傷。依達拉奉血—腦屏障穿透率約60%,可在腦內達到有效治療濃度。超敏C反應蛋白(hs-CRP）是應用新的技術檢測的C反應蛋白(CRP）,在急性炎癥或組織損傷、壞死時,IL—1和TNF—α可誘導IL—6的產生,而CRP基因轉錄主要受IL—6的調控,因此CRP濃度迅速上升。近期很多研究證明CRP與動脈粥樣硬化斑塊的形成,破裂及脫落有關,也有報道指出CRP是判斷腦血管病患者病情及預后的指標。D-二聚體是纖溶酶水解纖維蛋白形成的特異性降解產物,它是由纖維蛋白原,可溶性和交聯性纖維蛋白的共同降解而成。近年來,D-二聚體的定量檢測已廣泛應用于臨床,檢測D-二聚體的含量對肺栓塞,血栓性疾病,DIC及腫瘤等疾病診斷和治療有重要意義,被視為體內高凝狀態和纖溶亢進的分子標志物之一。血漿D-二聚體水平變化可作為判斷急性腦梗死患者病情及評估預后的敏感標志物。

本實驗研究發現對急性腦缺血損傷的大鼠用依達拉奉處理后,明顯改善神經癥狀,降低腦缺血損傷標記物CRP與D—二聚體,證明依達拉奉對急性腦梗死起改善神經癥狀及腦保護作用。總之,觀察體內D-二聚體的水平,根據測定結果,采取有效的防治措施,對降低ACI患者的發病率和死亡率具有十分重要的意義。本實驗研究示,D-二聚體測定在腦缺血組顯著高于正常組(P＜0.05）、腦缺血組顯著高于依達拉奉組(P＜0.05）、依達拉奉組顯著高于東菱迪芙組(P＜0.05）、東菱迪芙組顯著高于聯合用藥組(P＜0.05）、聯合用藥組顯著高于正常組。說明東菱迪芙與依達拉奉均可降低急性腦梗死D—二聚體水平,聯合用藥效果更佳,而且D—二聚體對大鼠腦缺血損傷是個敏感標記物。本次試驗通過腹腔注射東陵迪芙與依達拉奉,觀察大鼠局灶性腦缺血損傷前后血清hs-CRP及血漿D-二聚體水平的變化及神經行為評分,進一步證明東菱迪芙與依達拉奉對急性期腦缺血大鼠的腦保護作用,而且證明了聯合應用東菱迪芙與依達拉奉,效果更顯著。

腦缺血損傷嚴重危害人類生命及生活質量。隨著研究發展,溶栓技術的不斷改進和完善已解決了很多患者和醫務人員的苦惱,但隨之帶來的副作用仍危及患者的生命。降纖治療可間接起溶栓作用,其療效安全、可靠,但其針對血栓的溶栓作用有待于進一步發展。不管是溶栓治療,還是降纖治療均是治療急性期腦梗死的有效的治療方案,但均對腦組織帶來的再灌注損傷,因此,未來對腦缺血治療的研究中,研究減少出血風險,延長溶栓治療的時間窗是研究的重點,而且對損傷的神經元行保護治療也是研究的關鍵。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1）:84.

[2]Laing RJ,Jakubowski J,Laing RW.Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Which method works best?[J]Stroke,1993,24(2）:294.

[3]Garcia JH.A reliable method to occlude a middle cerebral artery inWistar rats[J].Stroke,1993,24(9）:1423.

[4]Holland JP,Sydserff SG,Taylor WA,et al.Rat models of middle cerebral artery ischemia[J].Stroke,1993,24(9）:1423.

[5]安泳潼,夏玉葉,閔 吻.缺血性腦卒中的發病機制及其治療[J].缺血性腦卒中的發病機制及其治療進展,2010,01,35.