大鼠BMSCs的體外分離培養和鑒定

李樹貴,于海翔,楊 光*

(1.柳河縣醫院外四科,吉林柳河 135300;2.吉林大學中日聯誼醫院）

骨髓間充質干細胞(MSCs）是一種來源于骨髓的成體干細胞,具有自我更新和多向分化能力。它不僅能分化為中胚層的成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等,近年的研究還發現可跨胚層分化為肝細胞[1]、神經細胞[2、3]、心肌細胞[4],因而引起了更廣泛的關注,已成為組織工程、基因治療和再生醫學中的研究熱點。在體外成功分離培養MSCs是研究其分化機制、基因調控、乃至實驗應用的前提。我們采用貼壁法分離培養大鼠骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs）,觀察其生物學特性和多向分化能力,并給予鑒定,為下一步實驗應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

選取出生5-7天的清潔級Wistar大鼠(體重6.0-8.0 g）,由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供。低糖DMEM培養基(GIBCO公司）、標準胎牛血清(GIBCO公司）、胰蛋白酶(Sigma公司）。

1.2 骨髓間充質干細胞的分離提取

將新生大鼠頸椎脫臼處死后,放入75%的乙醇內浸泡5 min。無菌條件下取出雙側股骨,去除附帶組織,兩端剪斷暴露骨髓腔。以1 ml注射器吸取低糖DMEM細胞培養液反復沖洗,至骨質發白為止,將所收集的細胞懸液用200目濾網過濾,制備成單細胞懸液。細胞計數后以1.0×106/ml接種到含20%胎牛血清的低糖DMEM細胞培養液的培養瓶內。

1.3 骨髓間充質干細胞的傳代培養和擴增

培養瓶置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。5天后首次半量換液,以后根據培養液顏色變化,每隔3-4天更換全部培養液1次。在貼壁細胞80%-90%融合后,吸盡培養液,以低糖DMEM培養液洗1遍后,加入適量0.25%胰蛋白酶,放入培養箱內消化30 s,倒置相差顯微鏡下觀察細胞成片收縮,棄掉胰酶,加入胎牛血清終止消化,低糖DMEM培養液洗1遍,加入含20%胎牛血清的低糖DMEM培養液,彎頭吸管輕輕吹打成單細胞懸液,以1∶2傳代擴增培養。

1.4 流式細胞儀測定細胞周期

取生長良好的第3代細胞,細胞數至少1×106個,消化離心收集后,加入到70%冰乙醇中20 min,1,000 rpm離心5 min,棄上清,PBS重懸細胞,200目濾網過濾,PBS洗2遍,以0.3 ml細胞周期染色液重懸細胞,4℃放置30 min,上流式細胞儀檢測。

1.5 成骨細胞誘導

第3代細胞傳代時,在培養瓶中預先放置玻片,觀察細胞70%-80%貼壁后,加入成骨誘導劑,各成分使用終濃度:地塞米松0.1 μ M、β-磷酸甘油鈉10 mM、抗壞血酸磷酸鹽50 uM。培養液為含10%胎牛血清的高糖D MEM細胞培養液,繼續在培養箱內培養,相差顯微鏡定期觀察,每3天半量換液,誘導2周,進行堿性磷酸酶(AKP）染色。

1.6 成脂肪細胞誘導

第3代細胞傳代時,在培養瓶中預先放置玻片,觀察細胞60%-70%貼壁后,更換成脂誘導培養基,為含20%馬血清的低糖DMEM細胞培養液。相差顯微鏡定期觀察,3天半量換液,共誘導2周,進行油紅O染色。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

相差顯微鏡下觀察,剛接種時為懸浮于培養液中的大小不等圓形細胞,48 h后可見少數細胞貼壁,為成纖維細胞樣細胞,以后貼壁細胞逐漸增多,約在9-12天80%-90%長滿培養瓶底,融合成單層,此時傳代,傳代后的 BMSCs形態更加均一,排列更加有序,呈魚群樣、漩渦狀或網狀排列,3-4天左右即可長滿培養瓶底。傳至第6代,形態無明顯變化,未出現衰老征象。

2.2 流式細胞儀測定細胞周期結果

通過流式細胞儀測定BMSCs細胞周期,發現平均11.41%的細胞處于S+G2+M期,88.59%處于G0/G1期(圖1）,提示BMSCs絕大多數處于靜止期,而少數處于S+G2+M期,即增殖期。

2.3 向成骨細胞誘導結果

誘導培養后,細胞變為多角形、不規則形,胞漿中含有較多顆粒,部分細胞聚集成集落,堿性磷酸酶染色呈陽性(圖2）。

2.4 向成脂肪細胞誘導結果

誘導培養3 d后,鏡下可見小部分細胞內有少量細小脂滴,以后內含脂滴的細胞逐漸增多,并且脂滴增大,融合成團,細胞也由長梭形變為圓形、橢圓形。誘導2周時油紅O染色,Giemsa復染,細胞內可見大小不等圓形脂滴空泡,部分被染成特異性橘紅色(圖3）。未經誘導的細胞胞漿中無脂滴,油紅染色陰性。

圖1 第3代BMSCs培養3天

圖2 BMSCs成骨誘導堿性磷酸酶染色(×200）胞漿中可見黑色顆粒沉著,呈陽性反應。

圖3 BMSCs成脂誘導油紅O染色、Gimesa復染(×400）胞漿內可見脂肪空泡,被油紅染成橘紅色。

3 討論

人們已經從骨、脂肪、臍血等多種組織中成功分離培養出間充質干細胞[5-8],但目前從骨髓中分離培養仍為獲取間充質干細胞的主要方法。由于間充質干細胞在骨髓中含量極少,貼壁生長干細胞僅占人骨髓中有核細胞的0.001%[5],故需特定的分離培養方法。1976年由Friedenstein等[8]首先利用貼壁法從小鼠的骨髓中分離得到間充質干細胞,他將全部骨髓細胞置于塑料培養皿中,根據干細胞在特定培養基中貼壁生長的特性,通過換液去除不貼壁的其它雜質細胞后,獲得呈梭形的貼壁干細胞。之后人們采用密度梯度離心法和貼壁法相結合,即根據骨髓中細胞成分密度的不同,先離心分離單個核細胞后再接種,之后通過貼壁法進一步純化。另外還有免疫磁珠法和流式細胞儀篩選法[9,10],但成本較高、技術難度大,加之骨髓間充質干細胞尚未發現其特有的表面標志,故應用較少,目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。

雖然密度梯度離心法可在原代獲得較純化的細胞,但BMSCs的分離密度尚未明確,且離心后仍需用貼壁法進一步純化,操作步驟復雜,離心過程中不可避免的造成細胞損失,故其優勢并不明顯。本實驗采用貼壁法分離培養大鼠BMSCs,利用干細胞貼壁生長的特性,換液去除懸浮的血細胞,并隨著細胞傳代,去除其它可貼壁的雜質細胞,經過傳代后細胞形態趨向一致,為成纖維細胞樣,從而獲得純化的細胞,具有操作簡便,費用低廉,成功率高的優點。有研究表明細胞經擴增1、2代后純度可達 95%和98%[5]。在先前的預實驗,小鼠BMSCs分離培養的過程中[11],我們發現隨著取材鼠齡增大,細胞活性和增殖能力下降,故本實驗選擇出生1周內的新生大鼠取材,所獲得細胞活性好,增殖能力強。傳至第6代,細胞形態無明顯變化,未出現衰老征象,適于進一步實驗應用。

在使用的血清濃度問題上,國內外不同的實驗室所用并不一致,報道多在5%-20%之間[12-14]。雖然也有人對比過不同濃度血清對所培養BMSCs的影響,但因實驗條件和所使用的血清來源不同,得出的結論也并不一致[15-17],故尚無統一標準。本實驗使用濃度20%的國產胎牛血清,細胞生長良好,并未過早出現生長停滯和分化的現象。對于細胞接種密度,如果密度過小,會造成細胞生長緩慢,甚至死亡;而密度過大,細胞間產生接觸抑制,也將致使生長緩慢,同時由于細胞代謝旺盛,導致換液頻繁,加大了工作量,增加了污染機率。經過摸索,我們認為原代接種時細胞密度4.0×105/cm2左右比較適合。

在相差顯微鏡下觀察,剛接種時為大小不等的多種細胞懸浮在培養液中,BMSCs逐漸貼壁生長,并拉長為成纖維細胞樣,經換液和傳代去除雜質細胞后,所獲細胞形態均一,排列有序,培養3～4天即可傳代擴增,表現了較強的增殖能力。

本實驗通過流式細胞儀檢測了第3代BMSCs的細胞周期,發現絕大部分細胞處于靜止期G1/G0期,少部分處于S+G2+M期,這和大多數文獻報道的相一致[18],說明絕大部分細胞處于靜止態,但保留自我更新和增殖能力,少部分處于功能態,符合干細胞的生長特性。具有多向分化能力是干細胞的另一主要特性,本實驗對所培養的BMSCs進行成骨和成脂肪誘導分化,鑒定結果顯示實現了向成骨和脂肪細胞分化。而未經誘導的細胞堿性磷酸酶染色為陰性,排除了所獲細胞為成骨細胞或成纖維細胞。

BMSCs的表面抗原表型并不是單一的,而是兼有間充質細胞、上皮細胞和肌肉細胞的特點,可表達細胞粘附分子、生長因子、細胞因子、細胞外基質成分等多種抗原。目前尚未發現可作為BMSCs標志物的特異性抗原[19,20],故無法直接鑒定得到的BMSCs。一般的鑒定方法都是通過培養傳代后,對所培養的細胞根據干細胞的生物學特性逆推,從而得知是否是BMSCs。本實驗所培養的細胞由骨髓取材,在特定的培養基中呈成纖維細胞樣貼壁生長,形態結構具有幼稚細胞的特征,并可分化為成骨和脂肪兩種不同的終末細胞,故可認為是骨髓來源的間充質干細胞。

綜上所述,我們在體外成功的分離培養和擴增了大鼠骨髓來源的間充質干細胞,熟悉了其一般生物學特性,并通過檢測其多向分化能力給予鑒定,為下一步實驗應用奠定了基礎。

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