不同化療藥物介入干預環(huán)境下對肝癌細胞系的敏感性

朱林忠,朱 旭,楊仁杰,寧 濤

(1.北京大學臨床腫瘤學院介入科;2.北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所,惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室;北京 100142）

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma）是常見惡性腫瘤之一,我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū),每年約有10余萬人死于肝癌,外科手術切除率不足1/3,對于多數(shù)中晚期惡性腫瘤患者往往缺少有效的治療手段;全身化療、放療和局部消融等治療方法效果仍然不滿意,經(jīng)動脈灌注化療栓塞術(transcatheter arterical chemoembolization,TACE）近年來以其可靠的療效及較低的并發(fā)癥逐漸成為中晚期原發(fā)性肝癌的首選治療方法[1,2];目前我院行介入治療時術中以栓塞為主,術后常規(guī)于腫瘤供血動脈留置導管6-48 h行持續(xù)動脈化療;采用2-3種化療藥物序貫化療;該方法改變了藥代動力學,避免了首過效應,顯著增加了局部濃度;但是絕大多數(shù)的肝癌發(fā)生在已存在肝臟疾病(慢性乙型、丙型病毒性肝炎和/或酒精性肝硬化）的基礎上,肝功能已有損害,肝癌細胞暴露于高濃度的細胞毒性藥物的同時,同時也能夠造成靶血管的損傷及鄰近正常肝組織的損傷;使肝星狀細胞、內皮細胞、庫弗氏細胞的活性增加,導致細胞外基質合成、代謝異常,促進肝纖維化的發(fā)生;

為此介入學界已經(jīng)進行了多種臨床實驗,證實小劑量動脈持續(xù)化療同樣可以達到滿意的臨床效果,同時極大的保護了人體功能;但是給藥的劑量仍舊混亂,也沒有考慮每個患者的腫瘤負荷及分布;給藥的時間、方式也沒有定論;為此設計本實驗以便找出臨床最適合的藥物、濃度、作用時間以及藥物序貫,在減少毒副反應的情況下保證療效;推進精細化及規(guī)范化的腫瘤介入化療。

1 材料與方法

1.1 化療藥物濃度的設定

經(jīng)動脈持續(xù)化療期間,局部血藥濃度極高,給藥期間,腫瘤組織中化療藥始終維持在高濃度狀態(tài);給藥結束后,該種藥物在腫瘤內的濃度急劇下降;目前關于化療藥對腫瘤的作用的大部分研究采取的濃度多為靜脈化療模式下的血藥濃度,與動脈化療實際能達到的濃度相差很大;各種高濃度的化療藥對腫瘤的作用也有研究,但是其作用時間臨床實踐難以達到;介入化療中如何確定局部血藥濃度目前仍沒有定論;即使按照統(tǒng)一方案給藥,每個患者的腫瘤供血量均不相同,局部血藥濃度差別也很大,造成局部用藥量不足/過剩;我們在介入治療術中測定了患者的肝癌供血動脈血流量,依據(jù)最終導管頭所處動脈的不同,血流量波動在0.5-6ml/s之間;根據(jù)這一結果及臨床藥物的常用劑量,我們計算出在各種情況下局部血藥濃度的范圍,在此范圍內選取5個階梯血藥濃度,每一種藥物濃度分別與肝癌細胞系作用4個不同的時間段。

表1 各種藥物的藥物濃度梯度及持續(xù)作用時間

1.2 實驗用試劑及儀器

1.2.1 試驗用藥物 藥物的選擇:目前,多數(shù)臨床研究均集中于蒽環(huán)類、5-Fu類、鉑類、喜樹堿類、吉西他濱等藥物[3-6],以奧沙利鉑、吉西他濱為基礎的新一代方案顯示了一定的療效優(yōu)勢和較好的安全性;為此,我們選擇了奧沙利鉑、順鉑、鹽酸表柔比星、鹽酸伊立替康、多西他賽、鹽酸吉西他濱、培美曲塞二鈉、5-氟尿嘧啶注射液作為觀察對象;分析方法采用常用的MTT法;各藥物來源如下:注射用鹽酸吉西他濱,0.2 g,哈爾濱譽衡藥業(yè)股份有限公司,100607;注射用培美曲塞二鈉,0.2 g,齊魯制藥有限公司,1010012DV;注射用奧沙利鉑,50 mg,賽諾菲,安萬特,2010.03;注射用順鉑,10 mg齊魯制藥有限公司,111023CF;5-氟尿嘧啶注射液,0.25 g,天津金耀氨基酸有限公司,20101123;注射用鹽酸表柔比星,輝瑞制藥(無錫）有限公司,1007021;多西他賽注射液;江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,10112612;注射用鹽酸伊立替康40 mg江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司20100409;

1.2.2 實驗用試劑及設備 96孔板:Costar 3599 Corning Incorporated,細胞系:人肝癌HepG-2細胞系,北京大學臨床腫瘤學院遺傳室提供;培養(yǎng)液:DMEM+10%胎牛血清;MTT:MTT(四甲基氮唑藍）:Sigma公司產(chǎn)品108178;DMSO:國藥集團化學試劑有限公司,分析純 101201;潔凈臺:Heal Force;孵育箱:SANYO MCO-15AC 37℃,5%CO2;顯微鏡:Olympus IX50倒置光顯微鏡;酶標儀:BIO-RAD Model 680 microplate Reader;

1.2.3 實驗方法 采用人肝癌細胞系HepG-2,接種于100 ml玻璃培養(yǎng)瓶中,在含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長,于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長,每2-3天傳代一次。至細胞足夠數(shù)量,按照每孔2×103個細胞備用;

將對數(shù)生長的人肝癌細胞HepG-2以2×103個/ml濃度100 μ l接種于96孔培養(yǎng)板上,加空白培養(yǎng)液90 μ l;DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后,其中化療藥與3種輔助用藥分別按照不同濃度各取10 μ l分別加入孔內,每一濃度加4個復孔,空白對照組加10 μ l培養(yǎng)液。藥物與細胞作用4h后,吸棄藥液及培養(yǎng)液,實驗組和空白組均以培養(yǎng)液反復清洗,更換空白培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至72 h,然后統(tǒng)一進行MTT檢測,每孔加入MTT(5 g/L）10 μ l培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO）200 μ l,在 BIO-RAD Model 680 microplate Reader型酶標儀上以570nm波長檢測各孔吸光度值(OD值,A值）,計算抑制率(%）=(1-A/A0）×100%。A:各藥物濃度組光吸收值(均值）,A0:未加藥物組(對照組）光吸收值(均值）。

2 結果

本實驗在人肝癌HepG-2細胞系中分別測定了9種化療藥物不同作用濃度和時間的作用特點,發(fā)現(xiàn)各種化療藥對肝癌細胞的抑制率存在較大差別,以奧沙利鉑、表柔比星、多柔吡星脂質體抑制率最高,5-Fu,順鉑、吉西他濱、培美曲塞二鈉、伊立替康次之,多西他賽抑制率較低;每一種藥物隨著濃度的提高,對肝癌細胞的抑制率增加,但是當濃度增加到一定程度后,其抑制率基本保持不變;作用時間對抑制率也有很大影響,但是大多數(shù)化療藥達到一定時間后其效果增加也趨于平緩。

下列各圖為不同濃度化療藥物與肝癌細胞系作用不同時間的結果,橫軸為作用時間,縱軸為抑制率,每一條曲線代表一種濃度的化療藥在不同作用時間下對肝癌細胞系的抑制率。

圖1 不同濃度奧沙利鉑與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

圖1中可以看出,奧沙利鉑在1 mg/L濃度下,其對腫瘤抑制率隨著時間的延長而持續(xù)增加,而當濃度提高到5 mg/L和10 mg/L,作用2-4 h抑制率提高較快,4 h后則提高程度趨緩;當濃度大于20 mg/L時,作用2 h和4 h抑制率差別不大,隨著時間延長抑制率未見提高,繼續(xù)提高至40 mg/L未見變化;說明奧沙利鉑在較低濃度情況下其抑制率與時間呈正相關,當濃度提高時,達到穩(wěn)定抑制率時間縮短,繼續(xù)提高濃度很快達到極限值。

圖2 不同濃度順鉑與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

圖2中可以看出,各個濃度的順鉑在2 h和4 h內抑制率差別不大,但是作用時間延長到6 h后,1 mg/L、5 mg/L濃度抑制率隨著時間的延長而輕度增加,當濃度提高到10 mg/L及更高濃度后,抑制率明顯增加,且差別不大,說明順鉑作用需要較高濃度及較長時間;6 h及10 mg/L濃度均達到較好的抑制效果。

圖3 不同濃度表柔比星與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

表柔比星起效迅速,除1 mg/L濃度需要4 h達到最大抑制率外,其它濃度在2 h即達到較為穩(wěn)定的抑制率,且各濃度下抑制率相近;說明該藥起效濃度低,需要維持的時間短。

圖4 不同濃度多西他賽與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

多西他賽在0.5 mg/L的低濃度下,其抑制率隨時間延長緩慢提高,到8 h時明顯提高,當濃度大于1 mg/L后,隨時間延長抑制率快速提高;繼續(xù)提高濃度抑制率提高緩慢;各個濃度到8 h時抑制率相近(圖3）。

圖5 不同濃度吉西他濱與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

吉西他濱在5 mg/L和10 mg/L的較低濃度下,其抑制率隨時間延長而緩慢提高;當濃度大于25 mg/L后,三個濃度下2-4 h抑制率增加,大于4 h后增加緩慢;各濃度之間無明顯差別(圖4）。

吉西他濱作用于S期,低濃度下表現(xiàn)為隨時間延長抑制率增加,但是在高濃度下作用方式也類似于CCNSA,較快達到最大抑制率,延長時間、增加濃度無明顯變化。

圖6 不同濃度 CPT-11與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

CPT-11在各個濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時間延長而增加,8 h以內抑制率持續(xù)提高,但是當濃度≥5 mg/L時抑制率不隨濃度增加而增加;單純表現(xiàn)為時間依賴特性(圖5）。

圖7 不同濃度培美曲塞二鈉與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

培美曲塞二鈉在各個濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時間延長而增加,各組濃度之間抑制率隨濃度增加輕度增加,更多表現(xiàn)為時間依賴特性(圖7）。

圖8 不同濃度5-Fu與HepG-2細胞系作用不同時間的結果

5-Fu隨著濃度增加,抑制率逐漸提高,大于10 mg/L后各濃度效果相近;24 h后抑制率增加緩慢(圖8）。

3 討論

經(jīng)動脈持續(xù)灌注化療模式下,藥物經(jīng)動脈泵持續(xù)、均勻的泵入,動脈血流也同時以相對恒定的流量流入腫瘤組織內,使得局部血液中及腫瘤組織內的藥物濃度在一特定時間段內始終保持相對穩(wěn)定狀態(tài);取得了全身化療無法取得的持續(xù)、穩(wěn)定的血藥濃度;在該時間段內,可以理解為腫瘤組織“浸泡”在恒定濃度的化療藥物中;且該藥物系直接接觸腫瘤,而沒有經(jīng)過人體代謝變化;為此我們完全可以在體外模擬出類似的藥物環(huán)境。

目前我科在原發(fā)性肝癌介入治療中常規(guī)于栓塞治療后留置導管,于病房行持續(xù)動脈灌注化療;較從前術中直接灌注,患者療效及耐受性均有改善;但是對于某一種化療藥的最佳作用時間及濃度仍缺乏基礎研究。

傳統(tǒng)實驗涉及實驗中所列項目,但是其濃度極少能達到臨床實踐中所能達到的濃度;高濃度下藥物的作用方面的資料較為零散;且其與作用時間的關聯(lián)缺乏報道;通過實驗,我們發(fā)現(xiàn),對于周期依賴型藥物如5-Fu、CPT-11、多西他賽、培美曲塞二鈉隨著濃度提高,抑制率增加;但是更多的表現(xiàn)為隨時間延長,療效增加[7-9]。

CPT-11在人體中該藥經(jīng)過肝臟代謝、轉化,會成為細胞毒性更強的SN-38,我們實驗中沒有能模擬出該代謝途徑;但是通過觀察CPT-11本身對肝癌細胞系的作用,發(fā)現(xiàn)在各個濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時間延長而增加,8h以內抑制率持續(xù)提高,但是當濃度≥5 mg/L時抑制率不隨濃度增加而增加;單純表現(xiàn)為時間依賴特性;實驗使用的是藥物原型,沒用使用其體內代謝產(chǎn)物SN-38;抑制率偏低可能與此有關。

培美曲塞二鈉為葉酸代謝抑制劑,近年來也逐漸用于肝癌治療;實驗結果顯示各個濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時間延長而增加,不除外隨時間進一步延長至8 h之外,抑制率會進一步增加。

吉西他濱的細胞毒性表現(xiàn)隨時間延長持續(xù)增加,這符合其細胞周期依賴型藥物的特點;但是實驗還顯示,當濃度≥25 mg/L與濃度≤10 mg/L效果差別明顯;這說明細胞周期依賴型藥物同樣在高濃度下可以達到更好的殺傷作用;當濃度≥25 mg/L時,各濃度之間無明顯差別;

濃度依賴型藥物奧沙利鉑、順鉑、鹽酸表柔比星對于動脈化療比較適合,雖然各自作用曲線不同,但是基本表現(xiàn)類似,在較低濃度情況下,作用效果同時間成正相關,在較高濃度下,則表現(xiàn)為起效時間縮短,延長時間療效增加不明顯;在高濃度情況下,則更多的表現(xiàn)為與濃度相關,延長時間并不能增加療效[10]。

藥物濃度和時間的關系:在低濃度情況下,藥物對腫瘤的抑制率歲時間延長而逐漸增加;但是隨著濃度的提高,其毒性作用很快即能達到最大值,繼續(xù)延長作用時間意義不大;從曲線中還可以看出,大多數(shù)藥物是有“飽和濃度”的,當濃度提高到一定程度時,繼續(xù)增加濃度,抑制率沒有明顯提高;每一種藥物都有各自最佳濃度—時間組合,在此濃度/時間之上則存在飽和現(xiàn)象;這提示我們用藥時要把握合適的劑量及時間,在保證足夠的細胞毒性前提下,減少藥物不良反應。

實驗結果表明,每一種藥物都有其適合的作用濃度及作用時間;臨床上完全可以根據(jù)每一個患者的具體情況設計用藥;在保證足夠濃度的情況下,沒有必要無限制的延長作用時間,這樣只能增加用藥總量,加重肝臟損傷及全身毒性。

實驗只檢測了各種藥物在肝癌細胞系中的作用,對于其它肝癌細胞系未作進一步檢測;細胞學代謝環(huán)境與生物體內環(huán)境的差別以及人體腫瘤的基因型的差異,該實驗結果與生物體內結果是否相符還需要進一步驗證;對于濃度依賴性藥物,最低濃度與下一濃度之間相差5倍,需要進一步實驗細化濃度梯度。

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