不同種類(lèi)微生物血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間的臨床意義探討

顧海彤,黃艷飛,孫宇峰,丁楠楠,魯辛辛

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100730）

菌血癥和敗血癥是臨床上嚴(yán)重危及生命的感染性疾病,進(jìn)展迅速、死亡率高。雖然廣譜抗生素的使用對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生很大的殺傷力,但隨之帶來(lái)院內(nèi)耐藥菌的增多、菌群失調(diào)、治療費(fèi)用高昂等多種問(wèn)題。因此快速診斷、盡早明確病原菌、合理使用抗菌藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。全自動(dòng)血培養(yǎng)儀的應(yīng)用,提高了血培養(yǎng)中微生物的陽(yáng)性檢出率,根據(jù)不同微生物特有的生長(zhǎng)特點(diǎn)和血培養(yǎng)儀陽(yáng)性報(bào)警的原理,可更早推斷微生物的類(lèi)型,幫助臨床醫(yī)師第一時(shí)間確定抗感染治療方案,挽救病人生命。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

本院2007年1月-2009年12月門(mén)、急診及住院患者的血標(biāo)本共計(jì)5516份,血培養(yǎng)儀提示陽(yáng)性報(bào)警的819份,分離菌株797株,無(wú)陽(yáng)性報(bào)警的4697份。

1.2 儀器和培養(yǎng)基

Bact/Alert 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及配套的培養(yǎng)瓶,包括成人中和抗生素需氧瓶和厭氧瓶;細(xì)菌鑒定使用VITEK及配套鑒定卡,其他常規(guī)分離培養(yǎng)基購(gòu)自天津金章醫(yī)用新技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

無(wú)菌操作采集血液標(biāo)本5-10 ml注入中和抗菌藥物FA培養(yǎng)瓶中,經(jīng)儀器掃描識(shí)別后直接放進(jìn)培養(yǎng)儀自動(dòng)進(jìn)行檢測(cè),隨時(shí)觀察生長(zhǎng)曲線并記錄陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間。

1.3.1 陽(yáng)性培養(yǎng)瓶的處理 當(dāng)儀器提示陽(yáng)性后,及時(shí)轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板(5%CO2環(huán)境）和麥康凱平板,置35℃孵育18-24 h,同時(shí)圖片、革蘭氏染色。

1.3.2 結(jié)果判斷 儀器顯示陽(yáng)性警報(bào),轉(zhuǎn)種培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng)者為陽(yáng)性;儀器顯示陽(yáng)性警報(bào),而涂片未見(jiàn)細(xì)菌,轉(zhuǎn)種培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者為假陽(yáng)性;儀器檢測(cè)5d無(wú)陽(yáng)性警報(bào),仍繼續(xù)保存在培養(yǎng)儀中直至7 d再觀察,確認(rèn)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)懷疑后為陰性;儀器無(wú)陽(yáng)性警報(bào),但涂片和盲目轉(zhuǎn)種有細(xì)菌生長(zhǎng)為假陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,將葡萄球菌屬、非發(fā)酵菌、鏈球菌屬、腸球菌屬和真菌分別與腸桿菌科細(xì)菌陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間進(jìn)行t檢驗(yàn),經(jīng)方差分析,腸桿菌科與葡萄球菌屬、非發(fā)酵菌、鏈球菌屬、腸球菌屬和真菌方差不等,選t'檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性率及陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間

用BA檢測(cè)5516份血培養(yǎng)標(biāo)本,分離出797株細(xì)菌,陽(yáng)性率為14%。最快報(bào)警時(shí)間為4 h,其中1 d內(nèi)檢出572株(71.8%）,1-2 d內(nèi)檢出183株(23.0%）,2-3 d內(nèi)檢出28株(3.5%）,3-4 d內(nèi)檢出11株(1.4%）,4-5 d內(nèi)檢出2株(0.3%）。腸桿菌科細(xì)菌陽(yáng)性報(bào)警所需培養(yǎng)時(shí)間較其他種類(lèi)微生物短,與其他類(lèi)型微生物比較差異有顯著性(P＜0.05）,鏈球菌屬除外。797份血液標(biāo)本細(xì)菌分布及報(bào)警時(shí)間,見(jiàn)表1。

表1 各菌屬細(xì)菌分布(株）及報(bào)警時(shí)間(h）

2.2 檢出菌株種類(lèi)

5516份血標(biāo)本中共檢出797株細(xì)菌,其中腸桿菌科細(xì)菌227株(28.4%）,非發(fā)酵菌150株(18.8%）,葡萄球菌屬134株(16.8%）,腸球菌屬108株(13.6%）,鏈球菌屬 61株(7.7%）,真菌106株(13.3%）,其他11株(1.4%）。

2.3 假陽(yáng)性率5516份血標(biāo)本中,儀器報(bào)警819份,其中22份血涂片和轉(zhuǎn)種未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng),假陽(yáng)性率為2.7%。

3 討論

全自動(dòng)血培養(yǎng)儀1 d內(nèi)檢出細(xì)菌的陽(yáng)性數(shù)占總檢出數(shù)66.4%,2 d內(nèi)檢出的陽(yáng)性數(shù)占91.8%,3d內(nèi)檢出的陽(yáng)性數(shù)占96.0%,4d內(nèi)檢出的陽(yáng)性數(shù)占98.2%,5 d內(nèi)檢出的陽(yáng)性數(shù)占100%,與國(guó)內(nèi)外報(bào)道[1,2]的BA系統(tǒng)陽(yáng)性檢出時(shí)間基本相似。因此建議血培養(yǎng)儀的常規(guī)檢測(cè)時(shí)間可以設(shè)定為5 d,達(dá)到了縮短檢測(cè)時(shí)間,又可以避免細(xì)菌漏檢的目的[3,4]。兒童瓶血培養(yǎng)時(shí)間可縮短至3 d[5]。

不同類(lèi)型的微生物有其不同的生長(zhǎng)代謝方式,微生物在培養(yǎng)基中代謝基質(zhì)或分解糖類(lèi)時(shí)產(chǎn)生CO2。產(chǎn)生CO2越多,培養(yǎng)瓶底部傳感器顏色由深變淺,發(fā)光二極管反射的光越強(qiáng),計(jì)算機(jī)接受此信息后以加速度、起始值和速率3種方式將產(chǎn)生的CO2量值與培養(yǎng)瓶中初始的CO2水平比較,最終判斷是否為陽(yáng)性,及時(shí)發(fā)出陽(yáng)性警報(bào),并顯示當(dāng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)這些原理,結(jié)合微生物相對(duì)特有的生長(zhǎng)特點(diǎn)及對(duì)碳水化合物的分解能力,可初步推斷微生物的類(lèi)型[6]。

腸桿菌科細(xì)菌多為兼性厭氧,在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,對(duì)培養(yǎng)條件要求不高,發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,遲緩期短,生長(zhǎng)期迅速,細(xì)菌增殖快,數(shù)量多,CO2產(chǎn)生快且多,故在血培養(yǎng)儀顯示生長(zhǎng)曲線遲緩期短,線型短,角度大,陽(yáng)性報(bào)警時(shí)甚至看不到穩(wěn)定期,與其他種類(lèi)微生物的生長(zhǎng)期曲線線型有明顯區(qū)別。276株腸桿菌科細(xì)菌,12 h內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警44株,占腸桿菌科陽(yáng)性的19.4%;24 h內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警208株,占腸桿菌科陽(yáng)性的75.4%。葡萄球菌屬為需氧或兼性厭氧菌,雖然葡萄球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高,在肉湯中生長(zhǎng)迅速,但對(duì)碳水化合物的發(fā)酵反應(yīng)不規(guī)則,分解葡萄糖后產(chǎn)酸[7],所以CO2的產(chǎn)生量和增加速度都不如腸桿菌科細(xì)菌。其生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期3個(gè)階段;平均陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間需要30 h,明顯比腸桿菌科細(xì)菌長(zhǎng)(P＜0.01）。非發(fā)酵菌一般為專(zhuān)性需氧菌,培養(yǎng)瓶由于加入了血液等耗氧物質(zhì),影響了非發(fā)酵菌的生長(zhǎng)環(huán)境,導(dǎo)致生長(zhǎng)較為緩慢,其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較短,較快轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。非發(fā)酵菌不發(fā)酵糖類(lèi),雖能氧化分解葡萄糖,但產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,所以CO2的產(chǎn)生量和增加的速度不會(huì)有明顯變化,遲緩期和穩(wěn)定期曲線因此較平坦。其培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng),平均報(bào)警時(shí)間為25.6 h。鏈球菌屬細(xì)菌為需氧或微需氧和厭氧菌,對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求高,大多數(shù)菌株還需要多種生長(zhǎng)因子;在普通培養(yǎng)基不易生長(zhǎng),對(duì)糖的分解能力因菌株而異,對(duì)葡萄糖分解后產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。這些因素都使鏈球菌屬細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)緩慢,CO2產(chǎn)生量少,所以培養(yǎng)儀顯示生長(zhǎng)曲線遲緩期較平坦,生長(zhǎng)期曲線角度小,穩(wěn)定期曲線比較平直。鏈球菌屬細(xì)菌出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警所需時(shí)間平均為21.3 h,較腸桿菌科細(xì)菌長(zhǎng),但考慮例數(shù)較少,統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異性。腸球菌屬與鏈球菌屬生長(zhǎng)曲線基本相同,出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警所需時(shí)間平均為20.6 h。酵母樣真菌(以白假絲酵母菌為主）整條生長(zhǎng)曲線較為圓滑,生長(zhǎng)期曲線呈一定角度緩和向上,培養(yǎng)儀出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間最長(zhǎng)為49.4 h。與其對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有其特殊要求有關(guān),所以其生長(zhǎng)不如腸桿菌科那樣,普通細(xì)菌培養(yǎng)基(液）就能適應(yīng)。

綜上所述,全自動(dòng)血培養(yǎng)儀采用第三代均質(zhì)熒光技術(shù),集培養(yǎng)、非接觸性瓶外連續(xù)檢測(cè)為一體其連續(xù)震蕩法有利于血液中的細(xì)菌從細(xì)胞內(nèi)釋出,配套的培養(yǎng)瓶營(yíng)養(yǎng)豐富、比例適當(dāng),更有利于微生物的快速生長(zhǎng),故血培養(yǎng)是目前確診敗血癥等最主要的診斷手段。但微生物的結(jié)果回報(bào)太慢對(duì)臨床醫(yī)師是最無(wú)奈的事。目前我科剛開(kāi)展基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)陽(yáng)性報(bào)警的原始血標(biāo)本測(cè)試,平均5min即可鑒定出細(xì)菌的種,再利用洗滌出的細(xì)菌原液進(jìn)行藥敏試驗(yàn),24 h后血培養(yǎng)鑒定及藥敏的結(jié)果即可告知臨床,較傳統(tǒng)方法報(bào)告臨床醫(yī)師提前了24-48 h,真正達(dá)到快速報(bào)告的目的,幫助醫(yī)師合理選擇有效的抗菌藥物,減少抗生素不合理使用帶來(lái)的諸多問(wèn)題。通過(guò)實(shí)驗(yàn),初級(jí)報(bào)告與最終報(bào)告鑒定的符合率達(dá)90%。

當(dāng)然微生物在培養(yǎng)過(guò)程中受多因素的影響,陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間的早晚也同樣會(huì)受到如抗菌藥物的使用、標(biāo)本含菌量、取材時(shí)間、取材量等影響,因此仍有待于在臨床實(shí)踐中不斷探討研究。

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